Regulamentul (CEE) nr. 2568/91 al Comisiei din 11 iulie 1991 privind caracteristicile uleiurilor de măsline și ale uleiurilor din resturi de măsline, precum și metodele de analiză a acestora

Sunt considerate uleiuri de măsline virgine, în sensul punctului 1 literele (a) și (b) din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiurile ale căror caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctele 1 și 2 la prezentul regulament.

Este considerat ulei de măsline lampant, în sensul punctului 1 litera (c) din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 3 la prezentul regulament.

Este considerat ulei de măsline rafinat, în sensul punctului 2 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate în anexa I punctul 4 la prezentul regulament.

Este considerat ulei de măsline compus din ulei rafinat și din uleiuri de măsline virgine, în sensul punctului 3 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 5 la prezentul regulament.

Este considerat ulei din reziduuri de măsline brut, în sensul punctului 4 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 6 la prezentul regulament.

Este considerat ulei din reziduuri de măsline rafinat, în sensul punctului 5 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 7 la prezentul regulament.

Este considerat ulei din reziduuri de măsline, în sensul punctului 6 din anexa la Regulamentul nr. 136/66/CEE, uleiul ale cărui caracteristici sunt conforme celor indicate la anexa I punctul 8 la prezentul regulament.

Caracteristicile uleiurilor prevăzute în anexa I se determină în conformitate cu următoarele metodele de analiză:

pentru determinarea acizilor grași liberi, exprimați în procente de acid oleic, metoda prevăzută în anexa II;

pentru determinarea indicelui de peroxid, metoda prevăzută în anexa III;

pentru determinarea conținutului de ceară, metoda prevăzută în anexa IV;

pentru determinarea compoziției și a conținutului de steroli și de dialcoolii triterpenici prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară, metoda prevăzută în anexa V;

pentru determinarea procentului de monopalmitat de 2-gliceril, metoda prevăzută în anexa VII;

pentru analiza spectrofotometrică, metoda prevăzută în anexa IX;

pentru determinarea compoziției de acizi grași, metoda prevăzută în anexa X;

pentru determinarea solvenților halogenați volatili, metoda prevăzută în anexa XI;

pentru evaluarea caracteristicilor organoleptice ale uleiului de măsline virgin, metoda prevăzută în anexa XII;

pentru determinarea stigmastadienelor, metoda prevăzută în anexa XVII;

pentru determinarea conținutului de trigliceride cu ECN42, metoda prevăzută în anexa XVIII;

pentru determinarea compoziției și a conținutului de steroli și pentru determinarea compușilor alcoolici prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară, metoda prevăzută în anexa XIX;

pentru determinarea conținutului de ceruri, esteri metilici ai acizilor grași și esteri etilici ai acizilor grași, metoda descrisă în anexa XX.

Verificarea de către autoritățile naționale sau de către reprezentanții acestora a caracteristicilor organoleptice ale uleiurilor virgine se efectuează în cadrul comisiilor de degustători aprobate de statele membre.

Atunci când autoritățile naționale sau reprezentanții acestora verifică caracteristicile uleiului după cum se prevede la alineatul (1), prelevarea probelor se efectuează în conformitate cu standardele internaționale EN ISO 661 privind pregătirea probei pentru analiză și EN ISO 5555 privind eșantionarea. Cu toate acestea, fără a aduce atingere punctului 6.8 din standardul EN ISO 5555, în cazul loturilor de astfel de uleiuri în ambalaje imediate, probele se prelevă în conformitate cu anexa Ia la prezentul regulament. În cazul uleiurilor în vrac pentru care eșantionarea nu se poate realiza în conformitate cu EN ISO 5555, eșantionarea se efectuează în conformitate cu instrucțiunile furnizate de autoritatea competentă a statului membru.

Pentru verificarea prevăzută la alineatul (3), în cazul produselor ambalate, analizele menționate la anexele II, III, IX, XII și XX, precum și, după caz, contraanalizele prevăzute de legislațiile naționale se efectuează înainte de data minimă de valabilitate. În cazul eșantionării de uleiuri în vrac, aceste analize se efectuează cel târziu în a șasea lună care urmează lunii în care a fost prelevată proba.

În scopul determinării caracteristicilor uleiurilor de măsline prin metodele prevăzute la alineatul (1) primul paragraf, rezultatele analizelor se compară direct cu limitele prevăzute de prezentul regulament.

În sensul prezentului articol, ulei de măsline comercializat înseamnă cantitatea totală de ulei de măsline și ulei din resturi de măsline a unui stat membru care este consumată în respectivul stat membru sau exportată din respectivul stat membru.

Statele membre se asigură că verificările conformității sunt efectuate în mod selectiv, pe baza unei analize a riscurilor, și cu o frecvență corespunzătoare, astfel încât să se asigure conformitatea uleiului de măsline comercializat cu categoria declarată.

Criteriile de evaluare a riscurilor pot include:

categoria de ulei, perioada de producție, prețul uleiurilor în raport cu alte uleiuri vegetale, operațiunile de amestecare și ambalare, instalațiile și condițiile de depozitare, țara de origine, țara de destinație, mijloacele de transport sau volumul lotului;

poziția operatorilor în lanțul de comercializare, volumul și/sau valoarea produselor comercializate de aceștia, gama de categorii de ulei pe care le comercializează, tipul de operațiune economică desfășurată, cum ar fi presarea, depozitarea, rafinarea, amestecarea, ambalarea sau vânzarea cu amănuntul;

constatările din timpul verificărilor precedente, inclusiv numărul și tipul defectelor constatate, calitatea obișnuită a uleiurilor comercializate, performanța echipamentelor tehnice utilizate;

fiabilitatea sistemelor de asigurare a calității sau a sistemelor de autocontrol ale operatorilor legate de conformitatea cu standardele de comercializare;

locul de desfășurare a verificării, în special dacă este vorba de primul punct de intrare în Uniune, ultimul punct de ieșire din Uniune sau locul în care uleiurile sunt produse, ambalate, încărcate ori vândute către consumatorul final;

orice alte informații care ar putea indica un risc de neconformitate.

Statele membre stabilesc în prealabil:

criteriile de evaluare a riscurilor de neconformitate a loturilor;

pe baza unei analize a riscurilor pentru fiecare categorie de risc, numărul minim de operatori sau loturi și/sau cantități care vor fi supuse unei verificări a conformității.

Statele membre verifică conformitatea:

efectuând în ordine aleatorie analizele prevăzute în anexa I; sau

respectând ordinea prevăzută de diagrama din anexa Ib, până se ajunge la una dintre deciziile menționate în diagramă.

Până la 28 februarie 1993, introducerea metodelor de analiză prevăzute la articolul 2 nu împiedică folosirea de către statele membre a altor metode verificate și valabile din punct de vedere științific, cu condiția ca produsele recunoscute a fi conforme cu normele în vigoare care reglementează metodele comunitare să fie lăsate să circule liber. Înainte de utilizarea altor metode, statele membre interesate le notifică Comisiei.

În cazul în care una dintre celelalte metode dă un rezultat diferit față de cel obținut prin metoda comună, va prevala rezultatul obținut prin aplicarea acesteia din urmă.

La apariția unei dispute cu privire la caracteristicile organoleptice ale unui ulei comercializat, părțile implicate pot supune subiectul în cauză atenției unei comisii de degustători autorizate, la alegerea lor.

În cazul în care se constată că un ulei nu corespunde descrierii categoriei sale și fără a aduce atingere niciunei alte sancțiuni, statul membru în cauză aplică sancțiuni eficace, proporționale și disuasive, care se vor stabili în funcție de gravitatea neregulii detectate.

Atunci când, în urma verificărilor, se constată nereguli semnificative, statele membre măresc frecvența verificărilor cu privire la etapa de comercializare, categoria de ulei, originea sa ori alte criterii.

The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

the requirements of Annex XII.4 are met,

the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Atunci când statele membre au dificultăți în înființarea comisiilor de degustători pe teritoriul lor, acestea pot solicita o comisie de degustători autorizată în alt stat membru.

Fiecare stat membru elaborează o listă cu comisiile de degustători înființate de organizații profesionale sau inter-filiale în conformitate cu condițiile prevăzute la alineatul (1) și asigură respectarea acestor condiții.

Notele adiționale 2, 3 și 4 la capitolul 15 din Nomenclatura combinată se înlocuiesc cu notele adiționale 2, 3 și 4 menționate în anexa XIV la prezentul regulament.

Conținutul de ulei din resturile și alte reziduuri rezultate din extragerea uleiului cu codurile NC 23069011 și 23069019 se determină în conformitate cu metoda prezentată în anexa XV.

Conținutul de ulei la care se face referire în alineatul (1) se exprimă ca procent din greutatea de ulei raportată la greutatea materiei uscate.

Se aplică dispozițiile comunitare privind prezența contaminanților.

În ceea ce privește concentrația de solvenți halogenați, limitele pentru toate categoriile de ulei de măsline sunt următoarele:

concentrația maximă pentru fiecare solvent halogenat detectat: 0,1 mg/kg;

concentrația maximă pentru suma solvenților halogenați detectați: 0,2 mg/kg.

Persoanele fizice sau juridice, precum și grupurile de persoane care dețin, în scopuri profesionale sau comerciale, ulei de măsline și ulei din resturi de măsline, începând cu etapa extracției în concasor până la etapa de îmbuteliere, inclusiv, sunt obligate să țină registre cu intrările și ieșirile pentru fiecare categorie de astfel de uleiuri.

Statul membru se asigură că obligația prevăzută la primul paragraf este respectată în mod corespunzător.

Statele membre informează Comisia cu privire la măsurile de punere în aplicare a prezentului regulament. Acestea informează Comisia cu privire la orice modificări ulterioare.

Până cel târziu la data de 31 mai a fiecărui an, statele membre transmit Comisiei un raport privind punerea în aplicare a prezentului regulament în cursul anului calendaristic anterior. Raportul conține cel puțin rezultatele verificărilor conformității efectuate în cazul uleiurilor de măsline, utilizând modelele prevăzute în anexa XXI.

Notificările menționate în prezentul regulament se efectuează în conformitate cu Regulamentul (CE) nr. 792/2009 al Comisiei.

Regulamentul (CEE) nr. 1058/77 se abrogă.

Prezentul regulament intră în vigoare în a treia zi de la data publicării în Jurnalul Oficial al Comunităților Europene.

Prezentul regulament nu se aplică uleiurilor de măsline și uleiurilor din resturi de măsline ambalate înainte de intrarea în vigoare a prezentului regulament și comercializate până la 31 octombrie 1992.

ANEXE

ANEXE

CUPRINS

ANEXA I

ANEXA I

CARACTERISTICILE ULEIURILOR DE MĂSLINE

Caracteristici de calitate

Caracteristici de puritate

Note:

Rezultatele analizelor trebuie exprimate cu același număr de zecimale ca cele indicate pentru fiecare caracteristică. Ultima cifră trebuie mărită cu o unitate în cazul în care cifra următoare este mai mare de 4.

Este de ajuns ca o singură caracteristică să nu fie conformă cu valorile indicate pentru ca uleiul să fie încadrat într-o altă categorie sau să fie declarat neconform, în sensul prezentului regulament.

Pentru uleiul de măsline lampant, cele două caracteristici de calitate marcate cu un asterisc (*) pot fi diferite în mod simultan de limitele stabilite pentru această categorie.

Caracteristicile marcate cu două asteriscuri (**) implică faptul că, pentru uleiurile brute din resturi de măsline, cele două limite aplicabile pot fi diferite de valorile indicate în mod simultan. Pentru uleiul din resturi de măsline și uleiul rafinat din resturi de măsline, una dintre limitele aplicabile poate fi diferită de valorile indicate.

Apendice

Arbori decizionali

Arborele decizional referitor la campesterol pentru uleiurile de măsline virgine și extravirgine:

Ceilalți parametri trebuie să respecte limitele stabilite în prezentul regulament.

Arborele decizional referitor la Delta-7-stigmastenol:

Uleiuri de măsline extravirgine și virgine

Ceilalți parametri trebuie să respecte limitele stabilite în prezentul regulament.

Uleiuri din resturi de măsline (brute și rafinate)

Ceilalți parametri trebuie să respecte limitele stabilite în prezentul regulament.

Uleiuri de măsline extravirgine și virgine

Uleiuri din resturi de măsline (brute și rafinate)

Apendice

Apendice

Arbori decizionali

Arborele decizional referitor la campesterol pentru uleiurile de măsline virgine și extravirgine:

Ceilalți parametri trebuie să respecte limitele stabilite în prezentul regulament.

Arborele decizional referitor la Delta-7-stigmastenol:

Uleiuri de măsline extravirgine și virgine

Ceilalți parametri trebuie să respecte limitele stabilite în prezentul regulament.

Uleiuri din resturi de măsline (brute și rafinate)

Ceilalți parametri trebuie să respecte limitele stabilite în prezentul regulament.

Uleiuri de măsline extravirgine și virgine

Uleiuri din resturi de măsline (brute și rafinate)

ANEXA Ia

ANEXA Ia

EȘANTIONAREA ULEIULUI DE MĂSLINE SAU A ULEIULUI DIN RESTURI DE MĂSLINE LIVRAT ÎN AMBALAJE IMEDIATE

Această metodă de eșantionare se aplică loturilor de ulei de măsline sau de ulei din resturi de măsline în ambalaje imediate. Se aplică diferite metode de eșantionare, în funcție de volumul ambalajului imediat (mai mic sau mai mare de 5 litri).

Directiva 2011/91/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 13 decembrie 2011 privind indicarea sau marcarea care permite identificarea lotului din care face parte un produs alimentar (JO L 334, 16.12.2011, p. 1).

Prelevare înseamnă cantitatea de ulei conținută într-un ambalaj imediat și extrasă dintr-un punct aleatoriu al lotului.

CONȚINUTUL UNEI PROBE PRIMARE

Ambalaje imediate care nu depășesc 5 litri

În cazul ambalajelor imediate care nu depășesc 5 litri, probă primară înseamnă numărul prelevărilor extrase dintr-un lot și conforme tabelului 1.

Numărul de ambalaje menționat în tabelul 1 și care constituie o probă primară poate fi mărit de către fiecare stat membru, în conformitate cu propriile nevoi (de exemplu, evaluarea organoleptică de către un alt laborator decât cel care a efectuat analizele chimice, contraanaliză etc.).

Ambalaje imediate care depășesc 5 litri

În cazul ambalajelor imediate care depășesc 5 litri, probă primară înseamnă o parte reprezentativă a prelevărilor totale, obținute printr-un proces de reducere și conforme tabelului 2. Probele primare trebuie să fie compuse din diferite specimene.

Specimen de probă primară înseamnă fiecare dintre ambalajele care compun proba primară.

Pentru a reduce volumul de ambalaje imediate la eșantionare, conținutul prelevărilor de eșantionare este omogenizat pentru pregătirea probei primare. Fracțiunile din diferitele prelevări sunt vărsate și amestecate într-un recipient comun în vederea omogenizării, într-un mod care să ofere o protecție optimală împotriva aerului.

Conținutul probei primare trebuie să fie turnat într-o serie de ambalaje cu o capacitate minimă de 1,0 litru, astfel încât fiecare dintre acestea să constituie un specimen din proba primară.

Numărul de probe primare poate fi mărit de către fiecare stat membru, în conformitate cu propriile nevoi (de exemplu, evaluarea organoleptică de către un alt laborator decât cel care a efectuat analizele chimice, contraanaliză etc.).

Fiecare ambalaj trebuie să fie umplut în așa fel încât să se reducă la minimum stratul superior de aer, după care este închis și sigilat în mod corespunzător pentru a se asigura protejarea produsului împotriva falsificării.

Specimenele trebuie să fie etichetate pentru a se garanta identificarea corectă a acestora.

ANALIZE ȘI REZULTATE

Fiecare probă primară trebuie să se împartă în probe de laborator, în conformitate cu punctul 2.5 din standardul EN ISO 5555, și trebuie să se analizeze urmându-se ordinea prezentată în diagrama prevăzută în anexa Ib sau în orice altă ordine aleatorie.

În cazul în care toate rezultatele analizelor sunt conforme caracteristicilor categoriei de ulei declarate, întregul lot este declarat conform.

Dacă un singur rezultat al analizelor nu este conform caracteristicilor categoriei de ulei declarate, întregul lot este declarat neconform.

VERIFICAREA CATEGORIEI LOTULUI

În vederea verificării categoriei lotului, autoritatea competentă poate mări numărul de probe primare extrase din diferite puncte ale lotului, în conformitate cu următorul tabel:

Fiecare prelevare care constituie o probă primară trebuie să fie extrasă din același loc al lotului, fiind necesar să se noteze amplasarea fiecărei probe primare, care să fie identificată în mod inechivoc.

Alcătuirea fiecărei probe primare trebuie să se efectueze în conformitate cu procedurile menționate punctele 1.1 și 1.2.

Fiecare probă primară este apoi supusă analizelor menționate la articolul 2 alineatul (1).

În cazul în care unul dintre rezultatele analizelor menționate la articolul 2 alineatul (1) pentru cel puțin o probă primară nu este conform caracteristicilor categoriei de ulei declarate, se declară neconform întregul lot de eșantionare.

ANEXA Ib

ANEXA Ib

DIAGRAMA PENTRU VERIFICAREA CONFORMITĂȚII UNEI PROBE DE ULEI DE MĂSLINE CU CATEGORIA DECLARATĂ

Tabel general

Tabelul 1 – Ulei de măsline extravirgin – Criterii de calitate

Tabelul 2 – Uleiuri de măsline virgine – Criterii de calitate

Tabelul 3 – Ulei de măsline extravirgin și virgin – Criterii de puritate

Tabelul 4 – Ulei de măsline lampant – Criterii de puritate

Tabelul 5 – Ulei de măsline rafinat – Criterii de calitate

Tabelul 6 – Ulei de măsline (compus din ulei de măsline rafinat și uleiuri de măsline virgine) – Criterii de calitate

Tabelul 7 – Ulei de măsline rafinat și ulei de măsline compus din ulei de măsline rafinat și uleiuri de măsline virgine – Criterii de puritate

Tabelul 8 – Ulei brut din resturi de măsline – Criterii de puritate

Tabelul 9 – Ulei rafinat din resturi de măsline – Criterii de calitate

Tabelul 10 – Ulei din resturi de măsline – Criterii de calitate

Tabelul 11 – Ulei rafinat din resturi de măsline și ulei din resturi de măsline – Criterii de puritate

ANEXA II

ANEXA II

DETERMINAREA ACIZILOR GRAȘI LIBERI, METODA LA RECE

OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Această metodă descrie determinarea acizilor grași liberi din uleiurile de măsline și din uleiurile din resturi de măsline. Conținutul de acizi grași liberi se exprimă prin aciditatea calculată ca procentaj de acid oleic.

PRINCIPIU

Se dizolvă o probă într-un amestec de solvenți, apoi se titrează acizii grași liberi prezenți cu ajutorul unei soluții de hidroxid de potasiu sau de hidroxid de sodiu.

REACTIVI

Toți reactivii trebuie să aibă o calitate analitică recunoscută, iar apa utilizată trebuie să fie distilată sau cu un grad de puritate echivalent.

Eter dietilic; etanol în concentrație de 95 % (V/V), amestec în volum de 1 la 1.

Se neutralizează exact în momentul folosirii cu soluția de hidroxid de potasiu (3.2) în prezența prin adăugarea a 0,3 ml din soluția de fenolftaleină (3.3) la 100 ml de amestec.

Eterul dietilic este foarte inflamabil și poate forma peroxizi explozivi. A se utiliza cu precauții speciale.

În cazul în care nu se poate utiliza eter dietilic, se poate folosi un amestec de solvenți conținând etanol și toluen. Dacă este necesar, etanolul se poate înlocui cu propanol-2.

Hidroxid de potasiu sau hidroxid de sodiu, soluție etanolică titrată sau soluție apoasă c(KOH) [sau c(NaOH)] aproximativ 0,1 mol/l sau, dacă este necesar, c(KOH) [sau c(NaOH)] aproximativ 0,5 moli la litru. Sunt disponibile soluții în comerț.

Concentrația exactă a soluției de hidroxid de potasiu (sau a soluției de hidroxid de sodiu) trebuie să fie cunoscută și verificată înainte de folosire. Se utilizează o soluție preparată cu cel puțin cinci zile înainte de folosire și decantată într-un flacon de sticlă maro cu un dop de cauciuc. Soluția trebuie să fie incoloră sau de nuanța galben pai.

Dacă se observă separarea fazelor atunci când se folosește soluție apoasă de hidroxid de potasiu (sau de hidroxid de sodiu), se înlocuiește soluția apoasă cu o soluție etanolică.

O soluție incoloră stabilă de hidroxid de potasiu (sau de hidroxid de sodiu) se poate prepara în modul următor. Se pun la fiert 1000 ml de etanol sau de apă cu 8 g de hidroxid de potasiu (sau de hidroxid de sodiu) și 0,5 g de pilitură de aluminiu și se continuă fierberea la reflux timp de o oră. Se distilează imediat. Se dizolvă în distilat cantitatea de hidroxid de potasiu (sau de hidroxid de sodiu) necesară. Se lasă în repaus timp de mai multe zile și se decantează lichidul limpede supernatant de precipitatul de carbonat de potasiu (sau de carbonat de sodiu).

Soluția poate fi preparată și fără distilare, astfel: la 1000 ml de etanol (sau de apă) se adaugă 4 ml de butilat de aluminiu și se lasă amestecul în repaus timp de câteva zile. Se decantează lichidul supernatant și se dizolvă cantitatea necesară de hidroxid de potasiu (sau de hidroxid de sodiu). Soluția se poate utiliza ca atare.

Fenolftaleină, soluție de 10 g/l în etanol în concentrație de 95-96 % (V/V) sau albastru alcalin 6B sau timolftaleină, soluție de 20 g/l în etanol în concentrație de 95-96 % (V/V). În cazul uleiurilor foarte colorate, se folosește albastru alcalin sau timolftaleină.

APARATURĂ

Materiale obișnuite de laborator, în special:

balanță analitică;

balon conic cu capacitatea de 250 ml;

biuretă cu capacitatea de 10 ml, clasa A, gradată la 0,05 ml, sau o biuretă automată echivalentă.

MOD DE LUCRU

Prepararea probei

Când este tulbure, proba trebuie filtrată.

Mostra

Se prelevează o probă, în funcție de aciditatea presupusă, după indicațiile din tabelul următor:

Se cântărește proba în balonul conic (4.2).

Determinare

Se dizolvă proba (5.2) într-o cantitate de 50-100 ml de amestec de eter dietilic și etanol (3.1), neutralizat în prealabil.

Se titrează în timp ce se agită, cu soluția de hidroxid de potasiu (sau de hidroxid de sodiu) de 0,1 mol/l (3.2) (a se vedea nota 4) până când se modifică indicatorul (culoarea indicatorului colorat persistă cel puțin 10 secunde).

În cazul în care cantitatea necesară de soluție de hidroxid de potasiu (sau de hidroxid de sodiu) de 0,1 mol/l depășește 10 ml, se folosește soluția de 0,5 mol/l sau se modifică masa probei în funcție de aciditatea liberă presupusă și de tabelul propus.

În cazul în care soluția devine tulbure în timpul titrării, se adaugă o cantitate suficientă de amestec de solvenți (3.1) pentru a se obține o soluție limpede.

O a doua determinare se efectuează doar dacă primul rezultat depășește limita specificată pentru categoria uleiului.

EXPRIMAREA REZULTATELOR

Aciditatea, exprimată în procente de acid oleic, în greutate, este egală cu:

unde:

Aciditatea oleică se raportează după cum urmează:

cu două zecimale pentru valorile de la 0 la 1 inclusiv;

cu o zecimală pentru valorile de la 1 la 100 inclusiv.

balanță analitică;

balon conic cu capacitatea de 250 ml;

biuretă cu capacitatea de 10 ml, clasa A, gradată la 0,05 ml, sau o biuretă automată echivalentă.

cu două zecimale pentru valorile de la 0 la 1 inclusiv;

cu o zecimală pentru valorile de la 1 la 100 inclusiv.

ANEXA III

ANEXA III

DETERMINAREA INDICELUI DE PEROXID

Domeniul de aplicare

Prezenta anexă descrie o metodă de determinare a indicelui de peroxid în uleiurile și grăsimile animale și vegetale.

Definiție

Indicele de peroxid reprezintă cantitatea de substanțe din probă (exprimată în miliechivalenți de oxigen activ la kilogram) care oxidează iodura de potasiu în condițiile de lucru descrise.

Principiu

Mostra sub formă de soluție într-un amestec de acid acetic și cloroform se tratează cu o soluție de iodură de potasiu. Iodul eliberat se titrează cu o soluție standardizată de tiosulfat de sodiu.

Aparatură

Echipamentele utilizate trebuie să fie lipsite de orice urmă de substanțe oxidante sau reducătoare.

Nota 1: nu se gresează suprafețele din sticlă rodată.

Lingură de sticlă de 3 ml.

Baloane de aproximativ 250 ml, cu gâtul și dopul din sticlă rodată, uscate în prealabil și umplute cu un gaz inert, uscat și pur (azot sau, de preferință, bioxid de carbon).

Biuretă cu capacitatea de 5 ml, 10 ml sau 25 ml, gradată la cel puțin 0,05 ml, preferabil cu ajustare automată la zero, sau o biuretă automată echivalentă.

Balanță analitică.

Reactivi

Cloroform de calitate analitică, fără oxigen (acesta din urmă fiind eliminat prin barbotarea unui curent de gaz inert, uscat și pur).

Acid acetic glacial de calitate analitică, fără oxigen (acesta din urmă fiind eliminat prin barbotarea unui curent de gaz inert, uscat și pur).

Iodură de potasiu în soluție apoasă saturată în urma unei preparări recente, fără iod și iodați. Se dizolvă aproximativ 14 g de iodură de potasiu în aproximativ 10 ml de apă la temperatura camerei.

Soluție apoasă de tiosulfat de sodiu la 0,01 mol/l (echivalând cu 0,01 N), standardizată cu precizie chiar înainte de utilizare.

Se prepară zilnic și înainte de utilizare noua soluție de tiosulfat de sodiu la 0,01 mol/l pornind de la o soluție standard de tiosulfat de sodiu la 0,1 mol/l sau se determină factorul exact de standardizare. Așa cum a demonstrat experiența, stabilitatea este limitată și depinde de valoarea pH-ului și de conținutul de dioxid de carbon liber. Pentru diluare se utilizează doar apă proaspăt fiartă, eventual purjată cu azot.

Se recomandă următoarea procedură pentru a determina factorul exact de standardizare al soluției de tiosulfat de sodiu:

Se cântăresc, cu o aproximare de 0,001 g, 0,27 până la 0,33 g de iodat de potasiu (mKIO3) într-un balon gradat (de 250 ml sau 500 ml) și se diluează până la gradație cu apă proaspăt fiartă (V2), răcită la temperatura camerei. Cu ajutorul unei pipete, se transferă 5 ml sau 10 ml din această soluție de iodat de potasiu (V1) într-un balon Erlenmeyer de 250 ml. Se adaugă 60 ml de apă proaspăt fiartă, 5 ml de acid clorhidric la 4 mol/l și 25 până la 50 mg de iodură de potasiu sau 0,5 ml din soluția saturată de iodură de potasiu. Această soluție se titrează cu ajutorul soluției de tiosulfat de sodiu (V3) pentru a determina factorul exact de standardizare al soluției de tiosulfat de sodiu.

T = m_(KIO3)V_1610w_(KIO3)M_(KIO3)V_2V_3

unde:

mKIO3 este masa în grame a iodatului de potasiu;

V1 este volumul soluției de iodat de potasiu, în mililitri (5 ml sau 10 ml);

V2 este volumul total al soluției de iodat de potasiu, în mililitri (250 ml sau 500 ml);

V3 este volumul soluției de tiosulfat de sodiu, în mililitri;

wKIO3 este puritatea iodatului de potasiu, în g/100 g;

MKIO3 este masa moleculară a iodatului de potasiu (214 g/mol);

T este factorul exact de standardizare al soluției de tiosulfat de sodiu (mol/l).

Soluție de amidon (dispersare apoasă de 10 g/l) preparată recent din amidon natural solubil. Pot fi utilizați, de asemenea, reactivi echivalenți.

Probă

Proba trebuie să fie prelevată și păstrată la adăpost de lumină, conservată la rece și închisă în recipiente de sticlă umplute în întregime și închise ermetic cu dopuri de plută sau de sticlă rodată.

Procedură

Testul trebuie să fie realizat la o lumină difuză (lumina zilei) sau artificială. Într-o lingură de sticlă (4.1) sau, la nevoie, într-un balon (4.2), se cântărește, cu o aproximare de 0,001 grame, una dintre masele probei menționate în tabelul următor, în funcție de indicele de peroxid prevăzut.

Se scoate dopul unui balon (4.2) și se introduce lingura de sticlă cu mostra. Se adaugă 10 ml de cloroform (5.1). Se dizolvă rapid mostra prin agitare. Se adaugă 15 ml de acid acetic (5.2), apoi 1 ml de soluție de iodură de potasiu (5.3). Se pune rapid dopul la loc, se agită timp de un minut și se lasă în repaus timp de exact 5 minute, la adăpost de lumină și la o temperatură cuprinsă între 15 și 25 °C.

Se adaugă aproximativ 75 ml de apă distilată. Se titrează iodul eliberat cu soluția de tiosulfat de sodiu (5.4) prin agitare puternică, utilizând soluție de amidon (5.5) ca indicator.

Se efectuează două determinări pe aceeași probă de testare.

Simultan, se efectuează un test martor. În cazul în care rezultatul acestuia din urmă este mai mare de 0,05 ml de soluție de tiosulfat de sodiu 0,01 N (5.4), se înlocuiesc reactivii impuri.

Exprimarea rezultatelor

Indicele de peroxid (IP), exprimat în miliechivalenți de oxigen activ la kilogram, este dat de formula:

unde:

Se ia drept rezultat media aritmetică a celor două determinări;

Se indică rezultatul determinării cu o precizie de o zecimală.

mKIO3 este masa în grame a iodatului de potasiu;

V1 este volumul soluției de iodat de potasiu, în mililitri (5 ml sau 10 ml);

V2 este volumul total al soluției de iodat de potasiu, în mililitri (250 ml sau 500 ml);

V3 este volumul soluției de tiosulfat de sodiu, în mililitri;

wKIO3 este puritatea iodatului de potasiu, în g/100 g;

MKIO3 este masa moleculară a iodatului de potasiu (214 g/mol);

T este factorul exact de standardizare al soluției de tiosulfat de sodiu (mol/l).

ANEXA IV

ANEXA IV

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE CEARĂ CU AJUTORUL CROMATOGRAFIEI ÎN FAZĂ GAZOASĂ CU COLOANĂ CAPILARĂ

OBIECT

Metoda descrie un procedeu de determinare a conținutului de ceară din uleiurile de măsline. Tipurile de ceară sunt definite în funcție de numărul de atomi de carbon. Metoda poate fi folosită în special pentru a deosebi uleiul de măsline obținut prin presare de cel obținut prin extracție (ulei din resturi de măsline).

PRINCIPIU

Materia grasă, la care s-a adăugat un standard intern adecvat, este fracționată prin cromatografie pe o coloană de silicagel hidratat; fracțiunea eluată prima în condițiile de testare (a cărei polaritate este mai mică decât cea a trigliceridelor) este recuperată, apoi analizată direct prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.

APARATURĂ

Pahar Erlenmeyer de 25 ml.

Coloană de sticlă pentru cromatografie în fază gazoasă, cu un diametru interior de 15 mm, o înălțime de 30-40 cm, echipată cu un robinet.

Cromatograf în fază gazoasă adaptat la funcționarea cu coloană capilară, echipat cu un sistem de introducere directă în coloană, alcătuit din:

Incintă termostatată pentru coloane, echipată cu un dispozitiv de programare a temperaturii;

Injector la rece pentru introducere directă în coloană;

Detector cu ionizare în flacără și convertizor-amplificator;

Aparat de înregistrare-integrator adaptat la funcționarea cu un convertizor-amplificator (3.3.3), cu un timp de răspuns sub 1 secundă și cu o viteză a hârtiei variabilă (se pot utiliza, de asemenea, sisteme informatizate de obținere a datelor de cromatografie în fază gazoasă cu ajutorul unui computer);

Coloană capilară de sticlă sau silice topită, cu o lungime de 8-12 m și un diametru interior de la 0,25-0,32 mm, acoperită în interior cu lichid de repartizare, într-un strat de grosime uniformă cuprinsă între 0,10 și 0,30 μm (lichide de repartizare adaptate utilizării, de tip SE 52 sau SE 54, în comerț).

Microseringă de 10 μl pentru introducerea directă în coloană, echipată cu un ac cementat.

Agitator electric.

Evaporator rotativ.

Cuptor închis.

Balanță analitică cu o precizie garantată a măsurii de + 0,1 mg.

Sticlărie standard de laborator.

REACTIVI

Silicagel cu o granulometrie cuprinsă între 60 și 200 μm.

Silicagelul se păstrează în cuptor la 500 °C timp de cel puțin patru ore. După răcire, se adaugă 2 % apă în raport cu cantitatea de silicagel prelevată. Se agită bine pentru a omogeniza cantitatea. Se păstrează la întuneric timp de cel puțin 12 ore înainte de utilizare.

n-hexan, pentru cromatografie.

Eter etilic, pentru cromatografie.

n-heptan, pentru cromatografie.

Soluție standard de lauril arahidat, la 0,1 % (m/V) în hexan (standard intern) (se poate utiliza, de asemenea, palmitat de palmitil sau stearat de miristil).

Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftol).

Gaz transportor: hidrogen sau heliu pur, pentru cromatografie în fază gazoasă.

Gaze auxiliare:

hidrogen pur, pentru cromatografie în fază gazoasă;

aer pur, pentru cromatografie în fază gazoasă.

MOD DE LUCRU

Pregătirea coloanei cromatografice

Se prepară o suspensie de 15 g de silicagel (4.1) în n-hexan (4.2) și se introduce pe coloană (3.2). Se lasă să se clarifice spontan și se definitivează clarificarea cu ajutorul unui agitator electric (3.5) pentru omogenizarea stratului de cromatografie. Se percolează 30 ml de n-hexan pentru a înlătura orice impurități. Se cântăresc cu exactitate cu ajutorul balanței (3.8) 500 mg din mostră în paharul Erlenmeyer de 25 ml (3.1), se adaugă cantitatea adecvată de standard intern (4.5), în funcție de conținutul de ceară estimat.

Se adaugă, de exemplu, 0,1 mg de lauril arahidat în cazul uleiului de măsline și între 0,25 și 0,5 mg pentru uleiul din resturi de măsline. Se transferă mostra astfel preparată în coloana cromatografică cu ajutorul a două doze de câte 2 ml de n-hexan (4.2).

Se lasă să scadă nivelul solventului până la 1 mm deasupra marginii superioare a absorbantului, apoi se percolează o cantitate suplimentară de 70 ml de n-hexan, pentru a elimina n-alcanii prezenți în mod natural. Se începe eluarea cromatografică prin colectarea a 180 ml de amestec de n-hexan/eter etilic, în raport de 99:1, la un debit de aproximativ 15 picături la fiecare 10 secunde. Eluarea mostrei se efectuează la o temperatură ambiantă de 22 ± 4 °C.

Note:

Amestecul de n-hexan/eter etilic (99:1) trebuie să fie pregătit zilnic.

Pentru a controla vizual eluarea corectă a cerii, se pot adăuga la mostra de soluție 100 μl de sudan de 1 % în amestecul de eluant. Deoarece colorantul prezintă o retenție intermediară între ceruri și trigliceride, eluarea trebuie întreruptă în momentul în care baza coloanei cromatografice se colorează, întrucât toate tipurile de ceară au fost eluate.

Fracțiunea astfel obținută este uscată într-un evaporator rotativ (3.6) până la eliminarea aproape totală a solventului. Ultimii 2 ml de solvent se elimină cu ajutorul unui ușor curent de azot; se adaugă apoi 2-4 ml de n-heptan.

Analiza prin cromatografie în fază gazoasă

Operațiuni preliminare

Se instalează coloana în cromatograful în fază gazoasă (3.3), conectând extremitatea de intrare la sistemul coloanei și extremitatea de ieșire la detector. Se efectuează controalele generale ale complexului de cromatografie în faza gazoasă (etanșeitatea circuitului de gaz, eficacitatea detectorului și a sistemului de înregistrare etc.).

În cazul în care coloana este folosită pentru prima dată, se recomandă ca aceasta să fie condiționată. Se trece un ușor flux de gaz prin coloană, apoi se conectează complexul de cromatografie în fază gazoasă. Se încălzește treptat până când se ajunge, după aproximativ 4 ore, la o temperatură de 350 °C. Se menține această temperatură timp de cel puțin două ore, apoi se reglează complexul la condițiile de funcționare [se reglează debitul de gaz, se aprinde flacăra, se conectează la aparatul de înregistrare electronic (3.3.4), se reglează temperatura camerei pentru coloană, detectorul etc.] și se înregistrează semnalul la o sensibilitate cel puțin de două ori mai mare decât cea prevăzută pentru efectuarea analizei. Traseul liniei de bază obținute trebuie să fie liniar, fără valori de vârf, de orice natură, și nu trebuie să prezinte abateri.

O abatere rectilinie negativă indică o etanșeitate imperfectă a conexiunilor coloanei; o abatere pozitivă indică o condiționare insuficientă a coloanei.

Alegerea condițiilor de funcționare

Condițiile de funcționare care trebuie respectate sunt, în general, următoarele:

temperatura coloanei:

temperatura detectorului: 350 °C;

cantitatea de substanță injectată: 1 μl de soluție (2-4 ml) de n-heptan;

gaz transportor: heliu sau hidrogen cu viteză lineară optimă pentru gazul selectat (a se vedea apendicele);

sensibilitatea instrumentelor: adaptată condițiilor de mai jos:

Aceste condiții pot fi modificate în funcție de caracteristicile coloanei și ale cromatografului în fază gazoasă, astfel încât să se obțină o separare a tuturor tipurilor de ceară, o rezoluție convenabilă a valorilor de vârf (a se vedea figura) și un timp de retenție al standardului intern C32, care trebuie să fie de 18 ± 3 minute. Valoarea de vârf cea mai reprezentativă a cerii trebuie să se situeze la cel puțin 60 % din scara totală.

Parametrii de integrare ai valorilor de vârf trebuie să fie astfel impuși încât să se obțină o evaluare corectă a ariilor valorilor de vârf care sunt luate în considerare.

Notă: Având în vedere temperatura finală ridicată, se admite o variație pozitivă, care nu trebuie să depășească 10 % din scara totală.

Efectuarea analizei

Se prelevează 1 μl de soluție cu microseringa de 10 μl; se trage înapoi pistonul seringii în așa fel încât acul să fie gol. Se introduce acul în complexul de injecție și după 1-2 secunde se injectează rapid; după aproximativ 5 secunde, acul se scoate lent.

Se procedează la înregistrare până la eluarea completă a cerii.

Linia de bază trebuie să corespundă întotdeauna condițiilor impuse.

Identificarea valorilor de vârf

Identificarea valorilor de vârf unice se efectuează pe baza timpilor de retenție și prin comparație cu amestecurile de ceară cu timpi de retenție cunoscuți, analizate în aceleași condiții.

Figura prezintă cromatograma cerii pentru un ulei de măsline virgin.

Evaluare cantitativă

Cu ajutorul integratorului, se procedează la calculul ariilor valorilor de vârf corespunzătoare standardului intern și esterilor alifatici de la C40 la C46.

Se calculează conținutul de ceară al fiecărui ester, în mg/kg de materie grasă, după formula:

unde:

EXPRIMAREA REZULTATELOR

Se indică suma conținuturilor diferitelor tipuri de ceară de la C40 la C46 în mg/kg de substanță grasă (ppm).

Notă: Componentele care trebuie cuantificate se referă la valorile de vârf cu număr par de atomi de carbon, cuprinse între esterii C40 și C46, după modelul cromatogramei cerii uleiului de măsline, prezentate în figura următoare. Pentru a identifica esterul C46, în cazul în care apare de două ori, se recomandă analizarea fracțiunii de ceară a unui ulei din resturi de măsline, a cărei valoare de vârf C46, prezentă în cantitate majoritară, este ușor de identificat.

Rezultatele se exprimă cu o zecimală.

Figură

După eluarea esterilor de steroli, traseul cromatografic nu trebuie să prezinte valori de vârf semnificative (trigliceride).

Legendă:

Apendice

Determinarea vitezei liniare a gazului

În cromatograful în fază gazoasă, reglat la condiții de funcționare normale, se injectează 1-3 μl de metan (sau propan). Se măsoară timpul în care gazul trece prin coloană, din momentul în care a fost injectat până când apare vârful (tM).

Viteza liniară în cm/sec se obține prin formula L/tM, unde L este lungimea coloanei în centimetri, iar tM este timpul măsurat în secunde.

hidrogen pur, pentru cromatografie în fază gazoasă;

aer pur, pentru cromatografie în fază gazoasă.

Amestecul de n-hexan/eter etilic (99:1) trebuie să fie pregătit zilnic.

Pentru a controla vizual eluarea corectă a cerii, se pot adăuga la mostra de soluție 100 μl de sudan de 1 % în amestecul de eluant. Deoarece colorantul prezintă o retenție intermediară între ceruri și trigliceride, eluarea trebuie întreruptă în momentul în care baza coloanei cromatografice se colorează, întrucât toate tipurile de ceară au fost eluate.

temperatura coloanei:

temperatura detectorului: 350 °C;

cantitatea de substanță injectată: 1 μl de soluție (2-4 ml) de n-heptan;

gaz transportor: heliu sau hidrogen cu viteză lineară optimă pentru gazul selectat (a se vedea apendicele);

sensibilitatea instrumentelor: adaptată condițiilor de mai jos:

Apendice

Apendice

Determinarea vitezei liniare a gazului

În cromatograful în fază gazoasă, reglat la condiții de funcționare normale, se injectează 1-3 μl de metan (sau propan). Se măsoară timpul în care gazul trece prin coloană, din momentul în care a fost injectat până când apare vârful (tM).

Viteza liniară în cm/sec se obține prin formula L/tM, unde L este lungimea coloanei în centimetri, iar tM este timpul măsurat în secunde.

ANEXA V

ANEXA V

DETERMINAREA COMPOZIȚIEI ȘI A CONȚINUTULUI DE STEROLI ȘI DE DIALCOOLI TRITERPENICI PRIN CROMATOGRAFIE ÎN FAZĂ GAZOASĂ CU COLOANĂ CAPILARĂ

DOMENIUL DE APLICARE

Metoda descrie procedura de determinare a conținutului de steroli, simpli și totali, și de dialcooli triterpenici în uleiurile de măsline și în uleiurile din resturi de măsline.

PRINCIPIU

Uleiul, la care s-a adăugat α-colestanol ca etalon intern, este saponificat cu hidroxid de potasiu în soluție etanolică, apoi se extrage substanța nesaponificabilă cu eter etilic.

Fracțiunea de steroli și de dialcooli triterpenici se separă de substanța nesaponificabilă prin cromatografie în strat subțire pe placă de silicagel bazic. Fracțiunile recuperate din silicagel se transformă în trimetilsilileteri și apoi se analizează prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.

APARATURA

Aparatura obișnuită de laborator și, în special, următoarele:

Balon de 250 ml echipat cu un condensator cu reflux cu racordurile din sticlă rodată.

Pâlnie de separare de 500 ml.

Baloane de 250 ml.

Echipament complet pentru analiză prin cromatografie în strat subțire cu plăci de sticlă de 20 × 20 cm.

Lampă cu lumină ultravioletă cu o lungime de undă de 254 sau 366 nm.

Microseringi de 100 μl și de 500 μl.

Pâlnie cilindrică de filtrare cu membrană poroasă G 3 (porozitate 15-40 μm) cu un diametru de aproximativ 2 cm și o înălțime de 5 cm, adaptată pentru filtrarea în vid cu un racord tată din sticlă rodată.

Balon conic cu vid de 50 ml cu un racord mamă din sticlă rodată, care este adaptabil la pâlnia de filtrare (punctul 3.7).

Eprubetă cu fund conic de 10 ml, prevăzută cu dop ermetic din sticlă.

Cromatograf cu gaz care poate fi utilizat cu coloană capilară, prevăzut cu un dispozitiv de injectare cu splitare, format din următoarele:

Etuvă cu termostat pentru coloane, care poate menține temperatura dorită cu o precizie de ± 1 °C;

Unitate de injectare termoreglabilă cu element vaporizator din sticlă tratată cu persilan și cu dispozitiv de splitare;

Detector cu ionizare în flacără (FID);

Sistem de culegere a datelor care poate fi utilizat cu detectorul FID (punctul 3.10.3.) și care poate efectua integrare manuală.

Coloană capilară de sticlă de siliciu cu o lungime de 20–30 m și un diametru interior de 0,25-0,32 mm, acoperită în interior cu 5 % difenil - 95 % dimetilpolisiloxan (faza staționară SE-52 sau SE-54 sau echivalent), cu o grosime uniformă cuprinsă între 0,10 și 0,30 μm.

Microseringă cu o capacitate de 10 μl, pentru cromatografie în fază gazoasă, cu ac cimentat, adecvată pentru injectarea cu splitare.

Exsicator cu diclorură de calciu

REACTIVI

Hidroxid de potasiu, titru minim 85 %.

Hidroxid de potasiu în soluție etanolică, la aproximativ 2 N.

Se dizolvă, prin răcire, 130 g de hidroxid de potasiu (punctul 4.1) în 200 ml de apă distilată, apoi se completează până la un litru cu etanol (punctul 4.10). Soluția se păstrează în vase de sticlă opacă bine închise și se depozitează maximum două zile.

Eter etilic, de calitate analitică.

Hidroxid de potasiu în soluție etanolică, la aproximativ 0,2 N.

Se dizolvă 13 g de hidroxid de potasiu (punctul 4.1) în 20 ml de apă distilată și se completează până la un litru cu etanol (punctul 4.10).

Sulfat de sodiu anhidru, de calitate analitică.

Plăci de sticlă (20 × 20 cm) acoperite cu silicagel fără indicator de fluorescență, cu o grosime de 0,25 mm (acestea sunt disponibile în comerț gata pentru utilizare).

Toluen, de calitate cromatografică.

Acetonă, de calitate cromatografică.

n-Hexan, de calitate cromatografică.

Eter etilic, de calitate cromatografică.

Etanol, de calitate analitică.

Acetat de etil, de calitate analitică.

Soluție de referință pentru cromatografie în strat subțire: colesterol sau fitosteroli și soluție de eritrodiol de 5 % în acetat de etil (punctul 4.11).

2′,7′ Diclorfluoresceină, soluție etanolică de 0,2 %. Aceasta este făcută ușor bazică prin adăugarea câtorva picături de soluție alcoolică de hidroxid de potasiu la 2 N (punctul 4.2).

Piridină anhidră, de calitate cromatografică (a se vedea nota 5).

Hexametil-disilazan, de calitate analitică.

Trimetilclorosilan, de calitate analitică.

Soluție de probă de trimetilsilileter de steroli.

Se prepară în momentul folosirii din steroli și eritrodiol extrași din uleiurile care le conțin.

α-colestanol, cu puritate de peste 99 % (puritatea trebuie să fie controlată prin analiză GC).

Soluție etalon intern de α-colestanol, soluție de 0,2 % (m/V) în acetat de etil (punctul 4.11).

Soluție de fenolftaleină, 10 g/l în etanol (punctul 4.10).

Gaz purtător: hidrogen sau heliu pur, puritate pentru cromatografie în fază gazoasă.

Gaze auxiliare: hidrogen, heliu, azot și aer, puritate pentru cromatografie în fază gazoasă.

n-Hexan (punctul 4.9)/eter etilic (punctul 4.10) amestec de 65:35 (V/V).

Reactiv de sililare, constituit dintr-un amestec de 9:3:1 (V/V/V) de piridină/hexametil-disilazan/trimetilclorosilan.

PROCEDURA

Prepararea substanței nesaponificabile

În balonul de 250 ml (punctul 3.1) se introduce, cu ajutorul microseringii de 500 μl (punctul 3.6), un volum de soluție etalon intern de α-colestanol (punctul 4.20) care conține o cantitate de colestanol corespunzătoare pentru aproximativ 10 % din conținutul de steroli ai probei. De exemplu, pentru 5 g de probă de ulei de măsline trebuie să se adauge 500 μg de soluție de α-colestanol (punctul 4.20) și 1500 μl în cazul uleiului din resturi de măsline. Se evaporă până la uscare cu un curent ușor de azot într-o baie caldă de aburi; după răcirea balonului se cântăresc 5 ± 0,01 g de probă uscată și filtrată în același balon.

În cazul uleiurilor și grăsimilor animale sau vegetale care conțin cantități considerabile de colesterol, poate fi prezentă o valoare de vârf cu un timp de retenție apropiat de cel al colestanolului. În astfel de cazuri, trebuie să se analizeze fracțiunea de steroli în duplicat, cu și fără etalon intern.

Se adaugă 50 ml de soluție etanolică de hidroxid de potasiu la 2 N (punctul 4.2) și câteva granule de piatră ponce, se pune în funcțiune condensatorul cu reflux și se încălzește până la o ușoară fierbere până când se produce saponificarea (soluția devine limpede). Se continuă încălzirea timp de 20 minute, apoi se adaugă 50 ml de apă distilată provenită din partea de sus a condensatorului, se deconectează condensatorul și se răcește balonul la aproximativ 30 °C.

Se transvazează cantitativ conținutul balonului într-o pâlnie de separare de 500 ml (punctul 3.2), adăugând apă distilată de mai multe ori (50 ml). Se adaugă aproximativ 80 ml de eter etilic (punctul 4.10), se agită energic timp de aproximativ 60 de secunde și se eliberează presiunea periodic, prin inversarea pâlniei de separare și deschiderea robinetului. Se lasă în repaus până la separarea completă a celor două faze (nota 2).

Apoi se extrage soluția de săpun cât mai complet posibil într-o a doua pâlnie de separare. Se fac încă două extracții pe fază de apă-alcool, în același mod, utilizând 60-70 ml de eter etilic (punctul 4.10).

Nota 2: Eventualele emulsii pot fi eliminate adăugând cantități mici de etanol (punctul 4.11).

Se combină cele trei extracte eterice într-o pâlnie de separare care conține 50 ml de apă. Se continuă spălarea cu apă (50 ml) până când apa de spălare nu mai prezintă o culoare roz la adăugarea unei picături de soluție de fenolftaleină (punctul 4.21).

După ce s-a eliminat apa de spălare, se filtrează pe sulfat de sodiu anhidru (punctul 4.5) într-un balon de 250 ml cântărit în prealabil, spălând pâlnia și filtrul cu mici cantități de eter etilic (punctul 4.10).

Se evaporă solventul prin distilare sub vid pe un evaporator rotativ la 30 °C. Se adaugă 5 ml de acetonă și se elimină complet solventul volatil într-un curent ușor de aer. Se usucă reziduul în cuptor la 103 ± 2 °C timp de 15 minute. Se răcește în exsicator și se cântărește cu o precizie de 0,1 mg.

Separarea fracțiunii de steroli și de dialcooli triterpenici (eritrodiol + uvaol)

Pregătirea plăcilor bazice pentru cromatografia în strat subțire. Se scufundă plăcile de silicagel (punctul 4.6) la aproximativ 4 cm în soluția etanolică de hidroxid de potasiu la 0,2 N (punctul 4.5) timp de 10 secunde, se lasă apoi să acționeze închise, sub hotă, timp de două ore și se pun, în final, în etuvă la 100 °C timp de o oră.

Se scot din etuvă și se păstrează într-un exsicator cu clorură de calciu (punctul 3.13) până în momentul folosirii (plăcile astfel tratate trebuie să fie folosite în termen de 15 zile).

Folosirea plăcilor bazice de silicagel pentru separarea fracțiunii de steroli elimină necesitatea tratării fracțiunii nesaponificabile cu alumină. În acest mod, toți compușii de natură acidă (acizi grași și alții) sunt reținuți pe linia de depunere, iar banda de steroli este separată net de banda de alcooli alifatici și triterpenici.

Se introduce în cuva de developare amestecul de hexan/etil (punctul 4.24) (Nota 4) până la o adâncime de aproximativ 1 cm. Se închide cuva folosind un capac corespunzător și se lasă astfel timp de cel puțin o jumătate de oră, la rece, în așa fel încât echilibrul lichid/vapori să se stabilizeze. Pe suprafețele interioare ale cuvei se pot fixa benzi de hârtie de filtru care se cufundă în eluant. Astfel se reduce cu aproximativ o treime timpul de developare și se obține o eluare mai uniformă a componentelor.

Amestecul de developare trebuie să fie schimbat la fiecare test, pentru a obține condiții de eluare perfect reproductibile. Se poate utiliza un solvent alternativ de n-hexan/eter etilic 50:50 (V/V).

Se prepară o soluție de aproximativ 5 % de nesaponificabile (punctul 5.1.5) în acetat de etil (punctul 4.12) și se depun, utilizând microseringa de 100 μl, 0,3 ml de soluție într-o linie fină și uniformă pe capătul inferior (2 cm) al plăcii cromatografice (punctul 5.2.1). În paralel cu linia de depozit, se depun, la una dintre extremitățile plăcii, 2–3 μl de soluție de referință (punctul 4.13), în scopul identificării sterolilor și a alcoolilor triterpenici după developare.

Se pune placa în cuva de developare pregătită conform indicațiilor de la punctul 5.2.2. Temperatura ambiantă trebuie să fie menținută între 15 și 20 °C (nota 5). Se închide imediat cu capacul și se eluează până când nivelul solventului ajunge la aproximativ 1 cm de marginea superioară a plăcii. Se scoate placa din cuva de developare și se trece la evaporarea solventului într-un curent de aer cald sau prin menținerea plăcii scurt timp sub hotă.

Nota 5: Temperatura mai mare ar putea afecta separarea.

Se vaporizează placa ușor și uniform cu soluție de 2′,7′ diclorfluoresceină (punctul 4.14) și apoi se lasă să se usuce. Atunci când placa se observă la lumină ultravioletă, se poate identifica banda de steroli și de dialcooli triterpenici prin alinierea cu petele obținute cu soluția de referință (punctul 4.13). Se delimitează benzile cu un creion negru de-a lungul marginilor de fluorescență (a se vedea placa de cromatografie în strat subțire, figura 3).

Cu o spatulă metalică, se curăță silicagelul din zona delimitată. Materialul extras, sfărâmat fin, se introduce în pâlnia de filtrare (punctul 3.7). Se adaugă 10 ml de acetat de etil cald (punctul 4.12), se amestecă cu grijă cu o spatulă metalică și se filtrează cu ajutorul vidului, apoi se colectează filtratul în balonul conic (punctul 3.8) conectat la pâlnia de filtrare.

Se spală reziduul din balon de trei ori cu eter etilic (punctul 4.3) (aproximativ 10 ml de fiecare dată) și se colectează filtratul în același balon conectat la pâlnia de filtrare, se evaporă filtratul până la obținerea unui volum de 4-5 ml, se transvazează soluția reziduală în eprubeta de 10 ml (punctul 3.9) cântărită în prealabil, se usucă încălzind-o ușor într-un ușor curent de azot, se continuă cu câteva picături de acetonă (punctul 4.8), uscând-o din nou.

Reziduul din eprubetă trebuie să fie alcătuit din fracțiunile de steroli și de dialcooli triterpenici.

Prepararea trimetilsilileterilor

Se adaugă, în eprubeta care conține fracțiunile de steroli și de dialcooli triterpenici, reactivul de sililare (punctul 4.25) (nota 6) într-o proporție de 50 μl pe miligram de steroli și de dialcooli triterpenici, evitând toate absorbțiile de umiditate (nota 7).

Soluțiile utilizabile ca atare sunt disponibile în comerț. De asemenea, sunt disponibili și alți reactivi de sililare, cum ar fi, de exemplu, bitrimetilsililtrifluoracetamida + 1 % trimetilclorosilan care trebuie să se dilueze cu un volum egal de piridină anhidră.

Piridina poate fi înlocuită cu aceeași cantitate de acetonitril.

Se închide eprubeta, se agită cu grijă (fără a o răsturna) până la solubilizarea completă a compușilor. Se lasă în repaus minimum 15 minute la temperatura ambiantă, apoi se centrifughează timp de câteva minute. Soluția limpede este gata pentru analiza prin cromatografie în faza gazoasă.

Eventuala formare a unei opalescențe ușoare este normală și nu provoacă nicio anomalie. Formarea unei floculații albe sau apariția unei colorații roz indică prezența umidității sau alterarea reactivului. În acest caz, trebuie să se repete testul (numai dacă se utilizează hexametildisilazan/trimetilclorosilan).

Analiza prin cromatografie în faza gazoasă.

Operațiuni preliminare, condiționarea coloanei capilare

Se instalează coloana (punctul 3.11) în cromatograful în fază gazoasă, legând extremitatea de intrare la injectorul cu splitare și extremitatea de ieșire la detector.

Se efectuează controalele generale ale complexului de cromatografie în fază gazoasă (etanșeitatea circuitului de gaz, eficacitatea detectorului, eficacitatea sistemului de splitare și a sistemului de înregistrare etc.).

În cazul în care se utilizează coloana pentru prima dată, se recomandă să se efectueze condiționarea sa: se trece un ușor flux de gaz de-a lungul acesteia, apoi se conectează complexul de cromatografie în fază gazoasă și se începe o încălzire treptată până când se atinge o temperatură cu cel puțin 20 °C mai mare decât cea de funcționare (nota 8). Se menține această temperatură timp de minimum 2 ore, apoi se asigură condițiile de funcționare pentru complex (reglarea fluxului gazos și a splitării, aprinderea flăcării, conectarea la sistemul de culegere a datelor, reglarea temperaturii coloanei, a detectorului și a injectorului etc.) și se înregistrează semnalul la o sensibilitate de cel puțin două ori mai mare decât cea prevăzută pentru executarea analizelor. Traseul liniei de bază obținute trebuie să fie liniar, fără valori de vârf de orice natură și nu trebuie să prezinte abateri.

O abatere rectilinie negativă indică o etanșeitate imperfectă a conexiunilor coloanei, o abatere pozitivă indică o condiționare insuficientă a coloanei.

Temperatura de condiționare trebuie să fie totdeauna cu cel puțin cu 20 °C mai mică decât temperatura maximă prevăzută pentru faza staționară folosită.

Alegerea condițiilor de funcționare.

Condițiile de funcționare sunt următoarele:

Temperatura coloanei: 260 ± 5 °C;

Temperatura injectorului: 280-300 °C;

Temperatura detectorului: 280-300 °C;

Viteza liniară a gazului purtător: heliu 20 - 35 cm/s; hidrogen 30 - 50 cm/s;

Raportul de splitare: de la 1:50 la 1:100;

Sensibilitatea instrumentelor: de la 4 la 16 ori atenuarea minimă,

Sensibilitatea de înregistrare: 1 - 2 mV scară totală;

Cantitatea de substanță injectată: 0,5 - 1 μl de soluție de TMSE.

Aceste condiții pot fi modificate în funcție de caracteristicile coloanei și ale cromatografului în fază gazoasă, pentru a se obține cromatograme care îndeplinesc următoarele cerințe:

Timpul de retenție pentru valoarea de vârf a ß-sitosterolului trebuie să fie de 20 ± 5 minute;

valoarea de vârf pentru campesterol trebuie să se situeze în cazul uleiului de măsline (conținut mediu 3 %) la 20 ± 5 % din scara totală, iar în cazul uleiului de soia (conținut mediu 20 %) la 80 ± 10 % din scara totală;

Toți sterolii prezenți trebuie să fie separați. Valorile de vârf separate să fie, de asemenea, complet rezolvate, ceea ce înseamnă că traseul valorii de vârf trebuie să se unească cu linia de bază înaintea de ieșirea pentru valoarea de vârf următoare. Cu toate acestea, o rezolvare incompletă este tolerată cu condiția ca valoarea de vârf la RRT 1,02 (sitostanol) să fie cuantificabilă folosind perpendiculara.

Protocolul de analiză

Se prelevează, cu microseringa de 10 μl, 1 μl de hexan, se aspiră 0,5 μl de aer și apoi 0,5 - 1 μl din soluția de probă. Se trage pistonul seringii în așa fel încât acul să fie gol. Se introduce acul prin membrana injectorului și, după 1–2 secunde, se injectează rapid și apoi se extrage lent acul, după aproximativ 5 secunde.

Se poate utiliza și un injector automat.

Se efectuează înregistrează până la eluarea completă a TMSE dialcoolilor triterpenici prezenți. Linia de bază trebuie să îndeplinească întotdeauna condițiile specificate(punctul 5.4.1.2).

Identificarea vârfurilor

Identificarea valorilor de vârf unice se efectuează pe baza timpilor de retenție și prin comparație cu TMSE al amestecului de steroli și de dialcooli triterpenici, analizați în aceleași condiții (a se vedea apendicele).

Sterolii și dialcoolii triterpenici sunt supuși procesului de eluare în următoarea ordine: colesterol, brasicasterol, ergosterol, 24-metilen-colesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol, Δ7-campesterol, Δ5,23-stigmastadienol, clerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol, eritrodiol și uvaol.

În tabelul 1 sunt prezentați timpii de retenție pentru ß-sitosterol, pentru coloanele SE-52 și SE-54.

Figurile 1și 2 prezintă cromatogramele tipice ale unor uleiuri.

Evaluarea cantitativă

Cu ajutorul sistemului de culegere a datelor, se procedează la calculul ariilor valorilor de vârf pentru α-colestanol și steroli și dialcoolii triterpenici. Nu se iau în considerare valorile de vârf eventuale ale compușilor care nu sunt incluși (ergosterolul nu trebuie calculat) printre cei enumerați în tabelul 1. Coeficientul de răspuns pentru α-colestanol se consideră a fi egal cu 1.

Se calculează concentrația pentru fiecare sterol, în mg/kg de materie grasă, după cum urmează:

sterol x = A_x m_s1000A_s m

unde:

Axaria de vârf a sterolului x, în unități ale sistemului de culegere a datelor;Asaria valorii de vârf a α-colestanolului, în unități ale sistemului de culegere a datelor;msmasa α-colestanol adăugat, în miligrame;mmasa probei utilizate pentru determinare, în grame.

EXPRIMAREA REZULTATELOR

Se raportează concentrația fiecărui sterol în mg/kg de substanță grasă și suma lor ca steroli totali.

Compoziția pentru fiecare sterol și eritrodiol și uvaol se exprimă cu o zecimală.

Compoziția de steroli totali trebuie să fie exprimată fără zecimale.

Se calculează procentul fiecărui sterol pornind de la raportul dintre aria valorii de vârf corespondente și suma ariilor valorilor de vârf pentru steroli:

sterol_x = A_xΣA100

unde:

Axaria valorii de vârf pentru x;ΣAsuma ariilor valorilor de vârf pentru steroli.

β-Sitosterol aparent: Δ5-23-stigmastadienol + clerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5-24-stigmastadienol.

Se calculează procentul de eritrodiol și uvaol:

Eritrodiol Uvaol = Er UvEr Uv ΣA 100

unde

ΣAsuma ariei pentru sterol, în unități ale sistemului de culegere a datelor;ERaria pentru eritrodiol, în unități ale sistemului de culegere a datelor;Uvaria pentru uvaol, în unități ale sistemului de culegere a datelor.

Apendice

Determinarea vitezei liniare a gazului

În cromatograful în fază gazoasă, reglat în condiții de operare normale, se injectează 1–3 μl de metan (sau propan) și se cronometrează timpul în care gazul parcurge coloana, între momentul de injecție și cel al ieșirii valorii de vârf (tM).

Viteza liniară în cm/s este dată de L/tM, unde L este lungimea coloanei în centimetri și tM este timpul cronometrat în secunde.

Figura 1

Cromatograma în fază gazoasă a fracțiunii de steroli și de dialcooli triterpenici a unui ulei de măsline lampant (eluat cu etalon intern)

Figura 2

Cromatograma în fază gazoasă a fracțiunii de steroli și de dialcooli triterpenici a unui ulei de măsline rafinat (eluat cu etalon intern)

Figura 3

Placa de cromatografie în strat subțire pentru uleiul din resturi de măsline, cu zona care trebuie să fie curățată pentru determinarea sterolilor și a dialcoolilor triterpenici

Scualen

Alcooli triterpenici și alifatici

Steroli și dialcooli triterpenici

Acizi grași inițiali și acizi grași liberi

Balon de 250 ml echipat cu un condensator cu reflux cu racordurile din sticlă rodată.

Pâlnie de separare de 500 ml.

Baloane de 250 ml.

Echipament complet pentru analiză prin cromatografie în strat subțire cu plăci de sticlă de 20 × 20 cm.

Lampă cu lumină ultravioletă cu o lungime de undă de 254 sau 366 nm.

Microseringi de 100 μl și de 500 μl.

Pâlnie cilindrică de filtrare cu membrană poroasă G 3 (porozitate 15-40 μm) cu un diametru de aproximativ 2 cm și o înălțime de 5 cm, adaptată pentru filtrarea în vid cu un racord tată din sticlă rodată.

Balon conic cu vid de 50 ml cu un racord mamă din sticlă rodată, care este adaptabil la pâlnia de filtrare (punctul 3.7).

Eprubetă cu fund conic de 10 ml, prevăzută cu dop ermetic din sticlă.

Cromatograf cu gaz care poate fi utilizat cu coloană capilară, prevăzut cu un dispozitiv de injectare cu splitare, format din următoarele:

Etuvă cu termostat pentru coloane, care poate menține temperatura dorită cu o precizie de ± 1 °C;

Unitate de injectare termoreglabilă cu element vaporizator din sticlă tratată cu persilan și cu dispozitiv de splitare;

Detector cu ionizare în flacără (FID);

Sistem de culegere a datelor care poate fi utilizat cu detectorul FID (punctul 3.10.3.) și care poate efectua integrare manuală.

Coloană capilară de sticlă de siliciu cu o lungime de 20–30 m și un diametru interior de 0,25-0,32 mm, acoperită în interior cu 5 % difenil - 95 % dimetilpolisiloxan (faza staționară SE-52 sau SE-54 sau echivalent), cu o grosime uniformă cuprinsă între 0,10 și 0,30 μm.

Microseringă cu o capacitate de 10 μl, pentru cromatografie în fază gazoasă, cu ac cimentat, adecvată pentru injectarea cu splitare.

Exsicator cu diclorură de calciu

Etuvă cu termostat pentru coloane, care poate menține temperatura dorită cu o precizie de ± 1 °C;

Unitate de injectare termoreglabilă cu element vaporizator din sticlă tratată cu persilan și cu dispozitiv de splitare;

Detector cu ionizare în flacără (FID);

Sistem de culegere a datelor care poate fi utilizat cu detectorul FID (punctul 3.10.3.) și care poate efectua integrare manuală.

Temperatura coloanei: 260 ± 5 °C;

Temperatura injectorului: 280-300 °C;

Temperatura detectorului: 280-300 °C;

Viteza liniară a gazului purtător: heliu 20 - 35 cm/s; hidrogen 30 - 50 cm/s;

Raportul de splitare: de la 1:50 la 1:100;

Sensibilitatea instrumentelor: de la 4 la 16 ori atenuarea minimă,

Sensibilitatea de înregistrare: 1 - 2 mV scară totală;

Cantitatea de substanță injectată: 0,5 - 1 μl de soluție de TMSE.

Timpul de retenție pentru valoarea de vârf a ß-sitosterolului trebuie să fie de 20 ± 5 minute;

valoarea de vârf pentru campesterol trebuie să se situeze în cazul uleiului de măsline (conținut mediu 3 %) la 20 ± 5 % din scara totală, iar în cazul uleiului de soia (conținut mediu 20 %) la 80 ± 10 % din scara totală;

Toți sterolii prezenți trebuie să fie separați. Valorile de vârf separate să fie, de asemenea, complet rezolvate, ceea ce înseamnă că traseul valorii de vârf trebuie să se unească cu linia de bază înaintea de ieșirea pentru valoarea de vârf următoare. Cu toate acestea, o rezolvare incompletă este tolerată cu condiția ca valoarea de vârf la RRT 1,02 (sitostanol) să fie cuantificabilă folosind perpendiculara.

Apendice

Apendice

Determinarea vitezei liniare a gazului

În cromatograful în fază gazoasă, reglat în condiții de operare normale, se injectează 1–3 μl de metan (sau propan) și se cronometrează timpul în care gazul parcurge coloana, între momentul de injecție și cel al ieșirii valorii de vârf (tM).

Viteza liniară în cm/s este dată de L/tM, unde L este lungimea coloanei în centimetri și tM este timpul cronometrat în secunde.

Figura 1

Cromatograma în fază gazoasă a fracțiunii de steroli și de dialcooli triterpenici a unui ulei de măsline lampant (eluat cu etalon intern)

Figura 2

Cromatograma în fază gazoasă a fracțiunii de steroli și de dialcooli triterpenici a unui ulei de măsline rafinat (eluat cu etalon intern)

Figura 3

Placa de cromatografie în strat subțire pentru uleiul din resturi de măsline, cu zona care trebuie să fie curățată pentru determinarea sterolilor și a dialcoolilor triterpenici

Scualen

Alcooli triterpenici și alifatici

Steroli și dialcooli triterpenici

Acizi grași inițiali și acizi grași liberi

ANEXA VIDETERMINAREA CONȚINUTULUI DE ERITRODIOL ȘI DE UVAOL

ANEXA VI

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE ERITRODIOL ȘI DE UVAOL

INTRODUCERE

Eritrodiolul (termen generic care desemnează în mod convențional ansamblul de dioli eritrodiol și uvaol) este un element constitutiv al nesaponificabilului care se găsește în anumite tipuri de materii grase. Dozarea sa poate să servească la verificarea prezenței uleiului de măsline de extracție, concentrația sa fiind net mai ridicată decât în celelalte uleiuri (uleiuri de măsline obținute prin presare, uleiuri de sâmburi de struguri).

OBIECT

Metoda descrie procedeul de determinare a conținutului de eritrodiol din materiile grase.

PRINCIPIUL METODEI

Substanța grasă este saponificată cu soluție de hidroxid de potasiu în etanol. Se extrage apoi nesaponificabilul cu eter etilic, purificat prin trecerea pe o coloană de alumină și fracționat prin cromatografie în strat subțire pe plăcile de silicagel. În acest mod, benzile de fracțiuni sterolică și eritrodiolică sunt izolate.

Sterolii și eritrodiolul recuperați pe placă sunt transformați în trimetilsilileteri și analizați prin cromatografie în fază gazoasă.

Rezultatul se exprimă în procente de eritrodiol în raport cu ansamblul eritrodioli + steroli.

APARATURĂ

Aparatura descrisă în anexa V (determinarea conținutului de steroli).

REACTIVI

Reactivi enumerați în anexa V (determinarea conținutului de steroli).

Soluție de referință de eritrodiol de 0,5 % în cloroform.

MODUL DE LUCRU

Prepararea nesaponificabilului

Se procedează conform indicațiilor de la punctul 5.1.2 din anexa V.

Separarea eritrodiolului și sterolilor

A se vedea punctul 5.2.1 din metoda descrisă în anexa V.

A se vedea punctul 5.2.2 de la aceeași metodă.

Se prepară o soluție de nesaponificabil (de 5 %) în cloroform.

Cu microseringa de 0,1 ml, se depune pe o placă cromatografică, la aproximativ 1,5 cm de marginea inferioară, 0,3 ml din soluția menționată anterior, într-o linie foarte fină cât mai uniform posibil.

La o extremitate a plăcii se depun, pentru referință, câțiva microlitri de soluție de colesterol și eritrodiol.

Se pune placa în cuva de developare pregătită conform indicațiilor de la punctul 5.2.1. Temperatura ambiantă trebuie să fie aproximativ 20 °C. Se închide imediat cu capacul și se eluează până când nivelul solventului ajunge la aproximativ 1 cm de marginea superioară a plăcii. Se ia apoi placa din cuva de developare și se evaporă solventul într-un curent de aer cald.

Se vaporizează uniform soluția de dicloro-2′ 7′ fluoresceină pe placă. Se examinează aceasta din urmă la lumină ultravioletă, se identifică benzile de steroli și eritrodiol prin aliniere cu elementele de referință, apoi se delimitează cu un vârf ascuțit ușor în afara marginilor de fluorescență.

Cu o spatulă metalică, se curăță silicagelul cuprins în zonele delimitate. Se introduce materialul scos de pe placă într-un balon de 50 ml. Se adaugă 15 ml de cloroform cald, se agită bine și se filtrează într-un balon cu filtru poros transferând silicagelul pe filtru. Se spală de trei ori cu cloroform cald (aproximativ 10 ml de fiecare dată) și se colectează filtratul într-un balon de 100 ml. Se evaporă până la obținerea unui volum de 4–5 ml, se transvazează într-o eprubetă de centrifugare cu fund conic de 10 ml cântărit în prealabil, se usucă încălzind ușor într-un curent de azot, apoi se cântărește.

Prepararea trimetilsilileterilor

Se procedează conform indicațiilor de la punctul 5.3 din metoda descrisă în anexa V.

Analiza prin cromatografie în fază gazoasă

Se procedează conform indicațiilor de la punctul 5.4 de la aceeași metodă. Analiza prin cromatografie în fază gazoasă trebuie să fie realizată în condiții care să permită respectarea cerințelor de analiză a sterolilor și de separare a TMSE, a eritrodiolului și a uvaolului.

După injectarea mostrei, se lasă hârtia să se deruleze până la eluarea completă a sterolilor prezenți, a eritrodiolului și a uvaolului. Se identifică apoi valorile de vârf (timpii de reținere relativi ai eritrodiolului și uvaolului, în raport cu β-sitosterolul, sunt de aproximativ 1,4, respectiv 1,55). Se calculează apoi ariile conform indicațiilor pentru steroli.

EXPRIMAREA REZULTATELOR

Procentul de eritrodiol = A_1A_2A_1A_2ΣA_(sterols)100 ,

în care:

A1aria valorii de vârf a eritrodiolului, în milimetri pătrați;A2aria valorii de vârf a uvaolului, în milimetri pătrați;ΣΑsterolisuma ariilor sterolilor prezenți, în milimetri pătrați.

Rezultatul se exprimă cu o zecimală.

ANEXA VII

ANEXA VII

DETERMINAREA PROCENTULUI DE MONOPALMITAT DE 2-GLICERIL

OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta metodă descrie procedura analitică de determinare a procentului de acid palmitic în poziția 2 a trigliceridelor cu ajutorul evaluării monopalmitatului de 2-gliceril.

Prezenta metodă se aplică uleiurilor vegetale lichide la temperatură ambiantă (20 °C).

PRINCIPIU

După preparare, mostra de ulei este supusă acțiunii lipazei pancreatice: o hidroliză parțială și specifică în pozițiile 1 și 3 ale moleculei de trigliceridă determină apariția monogliceridelor în poziția 2. Procentul de monopalmitat de 2-gliceril în fracțiunea de monogliceridă este determinat, după sililare, prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.

APARATURĂ ȘI MATERIALE

Pahar Erlenmeyer de 25 ml.

Pahare de laborator de 100, 250 și 300 ml.

Coloană de sticlă pentru cromatografie, cu diametru interior de 21-23 mm, lungime de 400 mm, echipată cu un disc din sticlă sinterizată și un robinet.

Eprubete gradate de 10, 50, 100 și 200 ml.

Baloane de 100 și 250 ml.

Evaporator rotativ.

Tuburi de centrifugare, cu capăt conic de 10 ml, cu dop din sticlă rodată.

Eprubetă de centrifugare pentru tuburi de 10 și 100 ml.

Termostat pentru menținerea temperaturii la 40 °C ± 0,5 °C.

Pipete gradate de 1 și 2 ml.

Seringă hipodermică de 1 ml.

Microseringă de 100 μl.

Pâlnie, 1000 ml.

Cromatograf în fază gazoasă pentru coloane capilare, echipat cu un dispozitiv de injecție on-column la rece pentru introducerea directă a mostrei în coloană și cu un cuptor capabil să mențină temperatura aleasă în limita a 1 °C.

Injector on-column la rece pentru introducerea directă a mostrei în coloană.

Detector cu ionizare în flacără și electrometru.

Aparat de înregistrare-integrator adaptat la electrometru cu un timp de răspuns sub 1 secundă și cu o viteză a hârtiei variabilă.

Coloană capilară de sticlă sau silice topită cu o lungime de 8-12 metri și un diametru interior de la 0,25-0,32 mm, acoperită cu metil-polisiloxan sau 5 % fenil-metil-polisiloxan, într-un strat cu o grosime cuprinsă între 0,10 și 0,30 μm, care poate fi utilizată la 370 °C.

Microseringă de 10 μl echipată cu un ac cementat, cu o lungime de cel puțin 7,5 cm pentru introducerea directă în coloană.

REACTIVI

Silicagel cu o granulometrie cuprinsă între 0,063 și 0,200 mm (70/280 Mesh), preparat astfel: se introduce silicagelul într-o capsulă de porțelan, se lasă la uscat în etuvă la 160 °C timp de 4 ore, apoi se lasă la răcit într-un desicator, la temperatura ambiantă. Se adaugă un volum de apă echivalent cu 5 % din greutatea silicagelului, astfel: într-un pahar Erlenmeyer de 500 ml, se cântăresc 152 g de silicagel și se adaugă 8 g de apă distilată, se pune dopul și se agită ușor pentru a obține o repartizare uniformă a apei. Se lasă în repaus cel puțin 12 ore înainte de utilizare.

n-hexan (pentru cromatografie). Hexanul poate fi înlocuit cu izooctan (2,2,4-trimetilpentan pentru cromatografie), cu condiția să se atingă valori de precizie comparabile.

Izopropanol.

Izopropanol, soluție apoasă 1/1 (V/V).

Lipază pancreatică. Lipaza utilizată trebuie să aibă o activitate cuprinsă între 2-10 unități de lipază/mg. (Există în comerț lipaze pancreatice cu activitate cuprinsă între 2-10 unități/mg de enzimă).

Soluție tampon de tri-hidroximetilaminometan soluție apoasă 1 M ajustată până la un pH de 8 (control cu potențiometrul) prin adăugarea de acid clorhidric concentrat (1/1 V/V).

Colat de sodiu, calitate enzimatică, soluție apoasă de 0,1 % (această soluție trebuie utilizată în decurs de 15 zile de la preparare).

Clorură de calciu, soluție apoasă de 22 %.

Eter dietilic pentru cromatografie.

Solvent de developare: amestec de n-hexan/eter dietilic (87/13 V/V).

Hidroxid de sodiu, soluție de 12 % din greutate.

Fenolftaleină, soluție de 1 % în etanol.

Gaz transportor: hidrogen sau heliu, pentru cromatografie în fază gazoasă.

Gaze auxiliare: hidrogen cu puritate de minimum 99 %, fără umiditate și impurități organice, și aer de puritate echivalentă, pentru cromatografie în fază gazoasă.

Reactiv silanizant: amestec de piridină/hexametildisilazan, trimetilclorosilan 9/3/1 (V/V/V) (în comerț există soluții gata preparate. Pot fi utilizați alți reactivi silanizanți, cum ar fi bi-trimetilsililtrifluorescentamida + 1 % trimetilclorosilan, diluați cu un volum egal de piridină anhidră).

Mostre de referință: monogliceride pure sau amestecuri de monogliceride cu o compoziție în procent cunoscută apropiată de cea a mostrei.

PROCEDURĂ

Prepararea mostrei

În cazul uleiurilor cu o aciditate liberă mai mică de 3 %, nu este necesară neutralizarea acestora înainte de cromatografia în coloană de silicagel. Uleiurile cu o aciditate liberă mai mare de 3 % se neutralizează în conformitate cu indicațiile de la punctul 5.1.1.1.

În pâlnia de 1000 ml (3.13) se introduc 50 g de ulei și 200 ml de n-hexan. Se adaugă 100 ml de izopropanol și o cantitate de soluție de hidroxid de sodiu de 12 % (4.11) corespunzătoare acidității libere a uleiului, majorată cu 5 %. Se agită energic timp de un minut. Se adaugă 100 ml de apă distilată, se agită din nou și se lasă în repaus.

După separare, se elimină stratul inferior de săpunuri. Se elimină orice straturi intermediare (mucilagii și materii insolubile). Se spală soluția de hexan de ulei neutralizat cu doze succesive de 50-60 ml de soluție izopropanol/apă 1/1 (V/V) (4.4), până când dispare culoarea roz a fenolftaleinei.

Se elimină cea mai mare parte de hexan prin distilarea sub vid (a se utiliza, de exemplu, un evaporator rotativ) și se transferă uleiul într-un balon de 100 ml (3.5). Se usucă uleiul în vid până la eliminarea totală a solventului.

La încheierea acestei operațiuni, aciditatea uleiului trebuie să fie mai mică de 0,5 %.

Se introduce 1 g de ulei preparat conform indicațiilor anterioare într-un pahar Erlenmeyer de 25 ml (3.1.) și se dizolvă în 10 ml de amestec de developare (4.10). Soluția se lasă în repaus timp de cel puțin 15 minute înainte de cromatografia în coloană de silicagel.

În cazul în care soluția este tulbure, se centrifughează pentru a asigura condiții optime pentru cromatografie. (Pot fi utilizate cartușe de silicagel SPE de 500 mg, gata pregătite.)

Pregătirea coloanei cromatografice

Se toarnă în coloană (3.3) aproximativ 30 ml de solvent de developare (4.10), se introduce o bucată de vată în partea de jos a coloanei cu ajutorul unei baghete de sticlă; se exercită presiune pentru a elimina aerul.

Într-un pahar de laborator, se prepară o suspensie de 25 g de silicagel (4.1) în aproximativ 80 ml de solvent de developare și se toarnă în coloană cu ajutorul unei pâlnii.

Se verifică dacă întreaga cantitate de silicagel a fost introdusă în coloană; se spală cu solvent de developare (4.10), se deschide robinetul și se lasă ca nivelul lichidului să ajungă la circa 2 mm deasupra nivelului superior al silicagelului.

Cromatografie în coloană

Într-un pahar Erlenmeyer de 25 ml (3.1), se cântărește exact 1 g din mostra preparată în conformitate cu indicațiile de la punctul 5.1.

Se dizolvă mostra în 10 ml de solvent de developare (4.10). Soluția se toarnă în coloana cromatografică pregătită în conformitate cu indicațiile de la punctul 5.1.3. Se evită balansarea suprafeței coloanei.

Se deschide robinetul și se lasă să se scurgă soluția mostrei până la atingerea nivelului de silicagel. Se developează cu ajutorul a 150 ml de solvent de developare. Se ajustează debitul la 2 ml/min. (astfel încât 150 ml să se scurgă în coloană în circa 60-70 de minute).

Se recuperează soluția eluată într-un balon de 250 ml, cântărit în prealabil. Se evaporă solventul sub vid și se înlătură ultimele urme ale acestuia cu ajutorul unui curent de azot.

Se cântărește balonul și se calculează materialul extras recuperat.

[În cazul utilizării unor cartușe SPE de silice gata preparate, se procedează astfel: se introduce 1 ml de soluție (5.1.2) în cartușele pregătite în prealabil cu 3 ml de n-hexan.

După percolarea soluției, se developează cu 4 ml de n-hexan/eter dietilic 9/1 (V/V).

Se recuperează soluția eluată într-o eprubetă de 10 ml și se utilizează un curent de azot pentru evaporarea până la uscare.

Reziduul uscat este supus acțiunii lipazei pancreatice (5.2). Este esențială verificarea compoziției de acizi grași înainte și după trecerea prin cartușul SPE].

Hidroliză cu lipază pancreatică

În eprubeta de centrifugare se cântăresc aproximativ 0,1 g de ulei preparat conform indicațiilor de la punctul 5.1. Se adaugă 2 ml de soluție tampon (4.6), 0,5 ml de soluție de colat de sodiu (4.7) și 0,2 ml de soluție de clorură de calciu, agitând bine după fiecare operațiune. Se închide eprubeta cu dopul din sticlă rodată și se pune în termostat la 40 ± 0,5 °C.

Se adaugă 20 mg de lipază, se agită cu grijă (se va evita umezirea dopului) și se pune eprubeta în termostat timp de exact 2 minute, apoi se scoate din termostat și se agită energic timp de exact 1 minut, după care se lasă la răcit.

Se adaugă 1 ml de eter dietilic, se închide și se agită energic, apoi se centrifughează și se transferă soluția de eter într-o eprubetă curată și uscată cu ajutorul unei microseringi.

Prepararea derivaților silanizați și a cromatografiei în fază gazoasă

Cu ajutorul unei microseringi, se introduc 100 μl de soluție (5.2.3) într-o eprubetă cu fund conic de 10 ml.

Se elimină solventul într-un ușor curent de azot, se adaugă 200 μl de reactiv silanizant (4.15), se astupă eprubeta și se lasă în repaus timp de 20 de minute.

După 20 de minute se adaugă între 1-5 ml de n-hexan (în funcție de condițiile cromatografice): soluția obținută este gata pentru cromatografia în fază gazoasă.

Cromatografia în fază gazoasă

Condițiile de funcționare sunt următoarele:

temperatura injectorului (injector on-column) mai mică decât temperatura de fierbere a solventului (68 °C);

temperatura detectorului: 350 °C;

temperatura coloanei: programarea temperaturii cuptorului: 60 °C timp de 1 minut, crescând cu 15 °C pe minut până la 180 °C, apoi cu 5 °C pe minut până la 340 °C, apoi 340 °C timp de 13 minute;

gaz transportor: hidrogen sau heliu, reglat la viteza lineară adecvată pentru a obține rezoluția indicată în figura 1. Timpul de retenție a trigliceridei C54 trebuie să fie de 40 ± 5 minute (a se vedea figura 2); (Condițiile de funcționare descrise anterior sunt propuse cu titlu indicativ. Fiecare operator va trebui să le optimizeze pentru a obține rezoluția dorită. Valoarea de vârf a monopalmitatului de 2-gliceril trebuie să atingă un nivel minim de 10 % din scara aparatului de înregistrare.);

cantitatea de substanță injectată: 0,5-1 μl de soluție (5 ml) de n-hexan (5.3.3).

Identificarea valorilor de vârf

Monogliceridele individuale sunt identificate în funcție de timpii de retenție obținuți și în raport cu cei obținuți prin amestecurile standard de mopogliceride analizate în aceleași condiții.

Evaluare cantitativă

Aria fiecărei valori de vârf se calculează cu ajutorul unui integrator electronic.

EXPRIMAREA REZULTATELOR

Procentul de monopalmitat de gliceril se calculează pe baza raportului dintre aria valorii de vârf corespunzătoare și suma ariilor valorilor de vârf ale tuturor monogliceridelor (a se vedea figura 2), după formula:

Monopalmitat de gliceril(%): A_xΣA100

unde:

Rezultatul trebuie exprimat cu o zecimală.

RAPORTUL ANALIZEI

Raportul analizei va trebui să precizeze:

trimiterea la această metodă;

orice informație necesară identificării integrale a mostrei;

rezultatul analizei;

orice abatere de la această metodă, fie că este vorba de o decizie a părților implicate, fie dintr-un alt motiv;

detaliile de identificare a laboratorului, data efectuării analizei și semnătura persoanelor responsabile de aceasta.

Figura 1

Cromatogramă a produșilor de silanizare, obținuți prin acțiunea lipazei asupra unui ulei de măsline rafinat cu adaos de 20 % ulei esterificat (100 %)

[Legendă: acides gras libres = acizi grași liberi; Huile d'olive raffinée + 20 % huile estérifiée = ulei de măsline rafinat + 20 % ulei esterificat; 1-2 monopalmitoléine = 1-2 monopalmitolein; 1-2 mono C18 insat = unsaturated 1-2 mono C18]

Figura 2

Cromatogramă a unui:

ulei de măsline neesterificat, după lipază; după silanizare; în aceste condiții (coloană capilară 8-12 mm), fracțiunea de ceară se eluează în același timp cu fracțiunea de digliceridă sau la puțin timp după aceasta.

După lipază, conținutul de trigliceride nu ar trebui să depășească 15 %.

Legendă:

Cromatogramă a unui:

ulei esterificat după lipază; după silanizare; în aceste condiții (coloană capilară 8-12 mm), fracțiunea de ceară se eluează în același timp cu fracțiunea de digliceridă sau la puțin timp după aceasta.

După lipază, conținutul de trigliceride nu ar trebui să depășească 15 %.

Legendă:

NOTE

PREPARAREA LIPAZEI

Lipaze cu un nivel de activitate satisfăcător sunt disponibile în comerț. Acestea pot fi, de asemenea, preparate în laborator după cum urmează:

Se răcesc 5 kg de pancreas proaspăt de porc la 0 °C. Se elimină grăsimea solidă și țesutul conjunctiv din jur, apoi se triturează într-un malaxor până la obținerea unei paste fluide. Se agită această pastă într-un agitator cu 2,5 litri de acetonă anhidră timp de 4-6 ore, apoi se centrifughează. Se efectuează alte trei extracții de reziduu cu același volum de acetonă anhidră, apoi două extracții cu un amestec 1/1 (V/V) de acetonă și de eter dietilic și două extracții cu eter dietilic.

Se usucă reziduul sub vid timp de 48 ore pentru a obține o pudră stabilă, care se păstrează timp îndelungat în frigider și ferită de umiditate.

CONTROLUL ACTIVITĂȚII LIPAZICE

Se prepară o emulsie de ulei de măsline astfel:

Se agită timp de 10 minute într-un agitator adecvat un amestec compus din 165 ml de soluție de gumă arabică de 100 g/l, din 15 g de gheață pisată și 20 ml dintr-un ulei neutralizat în prealabil.

Într-un pahar de laborator de 50 ml se toarnă succesiv câte 10 ml din această emulsie, apoi 0,3 ml de soluție de colat de sodiu de 0,2 g/ml și 20 ml de apă distilată.

Se plasează paharul de laborator într-un termostat menținut la 37 °C; se introduc electrozii unui pH-metru și un agitator cu spirală.

Cu ajutorul unei biurete, se adaugă soluția de hidroxid de sodiu 0,1 N picătură cu picătură, până când pH-ul atinge valoarea de 8,3.

Se adaugă o cantitate suficientă de suspensie apoasă de lipază (0,1 g/ml de lipază). Din momentul în care pH-metrul indică un pH de 8,3, se declanșează cronometrul și se începe adăugarea soluției de hidroxid de sodiu picătură cu picătură cu viteza necesară pentru a menține constant pH-ul de 8,3. Se notează la fiecare minut volumul de soluție consumat.

Se raportează observațiile pe o diagramă ce indică pe abscisă timpii și pe ordonată mililitrii de soluție alcalină de 0,1 N consumați pentru menținerea pH-ului constant. Rezultatul obținut trebuie să fie un grafic liniar.

Activitatea lipazei, exprimată în unități lipazice pe mg, este calculată cu ajutorul formulei următoare:

A = VN100m

unde:

Areprezintă activitatea în unități lipazice/mg;Vreprezintă numărul de mililitri de soluție de hidroxid de sodiu 0,1 N pe minut (calculat pe baza graficului);Nreprezintă valoarea normală a soluției de hidroxid de sodiu;mreprezintă masa în mg a mostrei de lipază.

Unitatea lipazică se definește ca fiind cantitatea de enzimă care produce 10 microechivalenți de acid pe minut.

temperatura injectorului (injector on-column) mai mică decât temperatura de fierbere a solventului (68 °C);

temperatura detectorului: 350 °C;

temperatura coloanei: programarea temperaturii cuptorului: 60 °C timp de 1 minut, crescând cu 15 °C pe minut până la 180 °C, apoi cu 5 °C pe minut până la 340 °C, apoi 340 °C timp de 13 minute;

gaz transportor: hidrogen sau heliu, reglat la viteza lineară adecvată pentru a obține rezoluția indicată în figura 1. Timpul de retenție a trigliceridei C54 trebuie să fie de 40 ± 5 minute (a se vedea figura 2); (Condițiile de funcționare descrise anterior sunt propuse cu titlu indicativ. Fiecare operator va trebui să le optimizeze pentru a obține rezoluția dorită. Valoarea de vârf a monopalmitatului de 2-gliceril trebuie să atingă un nivel minim de 10 % din scara aparatului de înregistrare.);

cantitatea de substanță injectată: 0,5-1 μl de soluție (5 ml) de n-hexan (5.3.3).

trimiterea la această metodă;

orice informație necesară identificării integrale a mostrei;

rezultatul analizei;

orice abatere de la această metodă, fie că este vorba de o decizie a părților implicate, fie dintr-un alt motiv;

detaliile de identificare a laboratorului, data efectuării analizei și semnătura persoanelor responsabile de aceasta.

ANEXA VIIIDETERMINAREA CONȚINUTULUI DE TRINOLEINĂ

ANEXA VIII

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE TRINOLEINĂ

OBIECT

Determinarea compoziției trigliceridelor din uleiurile vegetale lichide, sub formă de carbon echivalent, prin cromatografie în fază lichidă de înaltă performanță.

Prezenta normă descrie o metodă de separare și de determinare a cantității trigliceridelor din uleiurile vegetale sub formă de masă moleculară și de grad de nesaturare, luate ca funcții ale carbonului echivalent (a se vedea nota 1).

DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta normă se aplică tuturor uleiurilor vegetale ce conțin trigliceride de acizi grași cu lanț lung și este utilă în special pentru detectarea prezenței cantităților mici de uleiuri semisicative (bogate în acid linoleic) în uleiurile vegetale la care principalul acid gras nesaturat este acidul oleic (ulei de măsline).

PRINCIPIU

Separarea trigliceridelor după numărul lor de carbon echivalent, prin cromatografie în fază lichidă de înaltă performanță (faza inversă) și interpretarea cromatogramelor.

APARATURĂ

Aparat de cromatografie în fază lichidă de înaltă performanță care permite un control termostatic al temperaturii coloanei.

Seringă pentru injecții de 10 μl.

Detector: refractometru diferențial capabil să determine indicele de refracție cu aproximație de 10-4.

Coloană: tub din oțel inoxidabil cu o lungime de 250 mm și un diametru interior de 4,5 mm, prevăzut cu particule de siliciu cu diametru de 5 μm și conținând 22–23 % carbon sub formă de octadecilsilan (nota 2).

Aparat de înregistrare și/sau integrator.

REACTIVI

Reactivii trebuie să fie de puritate analitică, iar solvenții de eluare trebuie să fie degazați (ei pot fi reciclați de mai multe ori, fără ca acest lucru să aibă repercusiuni asupra separărilor).

Cloroform.

Acetonă.

Acetonitril.

Solvent de eluare: acetonitril + acetonă. (Proporțiile trebuie să fie ajustate în funcție de separarea dorită; se începe cu un amestec 50/50).

Solvent de solubilizare: acetonă sau amestec (1:1) de acetonă și cloroform.

Trigliceride de referință: trigliceride comerciale, precum tripalmitina, trioleina etc. (timpii de retenție trebuie să fie reluați în grafic după numărul de carboni echivalent), sau cromatograma de referință obținută datorită uleiului de soia (a se vedea notele 3 și 4 și schemele 1 și 2).

PREPARAREA MOSTRELOR

Se prepară o soluție la 5 % din mostrele de analizat prin cântărirea a 0,5 ± 0,0001 g de mostră într-un balon gradat de 10 ml și se completează până la 10 ml cu solventul de solubilizare (5.5).

MODUL DE LUCRU

Se montează sistemul cromatografic. Se pompează solventul de eluare (5.4) în proporție de 1,5 ml pe milimetru pentru a purja întregul sistem. Se așteaptă până la obținerea unei linii de bază stabile.

Se injectează 10 μl de mostră preparată conform indicațiilor de la punctul 6.

CALCULAREAȘI EXPRIMAREA REZULTATELOR

Se utilizează metoda de standardizare internă, altfel spus se presupune că suma procentelor ariilor valorilor de vârf corespunzând diverselor trigliceride este egal cu 100 %. Se calculează procentajul fiecărei trigliceride utilizând formula:

Procentul de trigliceride = aria valorii de vârfsuma ariilor valorilor de vârf100

Procentajul se calculează cu o zecimală

Nota 1: Este posibil să se determine ordinea de eluare prin calcularea echivalentului carbon, definit deseori prin raportul NCE = NC - 2n, unde NC este numărul atomilor de carbon și n numărul de legături duble. Se poate îmbunătăți calculul ținând seama de originea legăturilor duble. Dacă no, n1 și n1n reprezintă numărul de legături duble ce pot fi atribuite acizilor oleic, linoleic și linolenic, carbonul echivalent poate fi calculat după formula:

NCE = NC - dono - d1n1 - d1nn1n

unde coeficienții do, d1 și d1n pot fi calculați cu ajutorul trigliceridelor de referință. În condițiile specificate în prezenta metodă, rezultatul obținut este comparabil cu formula:

NCE = NC - (2,60no) - (2,35n1) - (2,17n1n).

Nota 2: Exemple: Licrosorb (Merck) RP 18 articolul 50333,

Licrosferă (Merck) 100 CH 18 articolul 50377 sau similare.

Nota 3: Cu mai multe trigliceride de referință, este posibil, de asemenea, să se calculeze rezoluția pentru trioleină.

α = TR′/TR′oleină

utilizând timpii de retenție corectați TR′ = TR - TRsolvent

Schema log α în funcție de f (număr de legături duble) permite determinarea indicilor de retenție pentru toate trigliceridele acizilor grași ai trigliceridelor de referință (a se vedea schema 2).

Nota 4: Eficacitatea coloanei trebuie să permită separarea netă a valorii de vârf a LLL (trilinoleici) de cea a trigliceridelor care au un timp de retenție apropiat.

Note 5:

Note 5: In order to permit clear separation of the peak of trillonlein from the adjacent peaks, crude olive-residue oil should be purified beforehand in accordance with point 6.2 of Annex VII or, alternatively:

200 μl of undiluted oil are abosorbed in a silica column for liquid-solid extraction (type SEP PAC silica cartridge-waters port. No 51900).

The triglycerides are eluted with 20 ml anhydrous hexane for HPLC.

The eluted product is dried in a nitrogen flow and placed in Isopropanol or acetone (5 ml). 10-20 μl are injected into HPLC. For these two purification methods, the fatty acid composition of the oil must be checked to ensure that it is the same before and after purification. If it is not the same, the absorbent quality used should be progressively reduced.

Schema 1

Cromatograma unei mostre de ulei de soia

Pacid palmitic;Stacid stearic;Oacid oleic;Iacid linoleic;Lnacid linolenic.

Schema 2

Evoluția logaritmului α în funcție de f (numărul legăturilor duble)

Numărul legăturilor duble (n)

Laacid lauric;Myacid miristic;Pacid palmitic;Stacid stearic;Oacid oleic;Lacid linoleic;Lnacid linolenic.

ANEXA IX

ANEXA IX

ANALIZĂ SPECTROFOTOMETRICĂ ÎN ULTRAVIOLET

INTRODUCERE

Examinarea spectrofotometrică în ultraviolet poate furniza indicații privind calitatea unei materii grase, starea de conservare a acesteia și modificările datorate proceselor tehnologice. Absorbțiile cu lungimi de undă prevăzute în metodă sunt datorate prezenței sistemelor de diene și triene conjugate rezultând din procese de oxidare și/sau din practici de rafinare. Valorile acestor absorbții sunt exprimate ca extincția specifică E^(1 %)_(1 cm) (extincția unei soluții de substanță grasă de 1 % greutate volumetrică în solventul prescris, într-o cuvă de 10 mm) notată în mod convențional cu K (denumit, de asemenea, coeficient de extincție).

DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta anexă descrie procedeul executării examinării spectrofotometrice în ultraviolet a uleiurilor de măsline.

PRINCIPIUL METODEI

Mostra se dizolvă în solventul necesar, apoi se măsoară absorbanța soluției la lungimile de undă prevăzute, în raport cu solventul pur.

Extincțiile specifice la 232 nm și 268 nm în izooctan sau la 232 nm și 270 nm în ciclohexan se calculează pentru o concentrație de 1 % greutate volumetrică într-o cuvă de 10 mm.

APARATURĂ

Un spectofotometru adecvat pentru măsurători la lungimi de undă ultravioletă (între 220 nm și 360 nm), cu posibilitate de citire pentru fiecare unitate nanometrică. Se recomandă o verificare regulată a preciziei și reproductibilității scărilor de absorbanță și de lungime de undă, precum și a luminii difuze.

Scara lungimii de undă: aceasta se poate verifica folosind un material de referință constând într-un filtru optic de sticlă ce conține oxid de holmiu sau o soluție de oxid de holmiu (sigilată sau nu), care are benzi de absorbție distincte. Materialele de referință sunt concepute pentru verificarea și calibrarea scării lungimilor de undă a spectrofotometrelor în domeniul vizibil și ultraviolet având lărgimea de bandă nominală spectrală de cel mult 5 nm. Măsurătorile sunt efectuate în raport cu o probă martor de aer, pe intervalul de lungimi de undă cuprins între 640 și 240 nm, conform instrucțiunilor care însoțesc materialele de referință. O corecție de referință se efectuează cu calea goală a fasciculului la fiecare modificare a lărgimii fantei. Lungimile de undă ale standardului sunt enumerate în certificatul materialului de referință.

Scara absorbanței: aceasta se poate verifica folosind materiale de referință sigilate disponibile în comerț constând în soluții de dicromat de potasiu în mediu acid, în anumite concentrații și cu valori certificate ale absorbanței la λmax (în 4 soluții de dicromat de potasiu în acid percloric, sigilate în patru cuve UV din cuarț pentru măsurarea liniarității și a preciziei fotometrice de referință în UV). Soluțiile de dicromat de potasiu sunt măsurate în raport cu o probă martor din acidul utilizat, după corecția de referință, conform instrucțiunilor care însoțesc materialul de referință. Valorile absorbanței sunt enumerate în certificatul materialului de referință.

O altă posibilitate de verificare a răspunsului celulei fotoelectrice și al fotomultiplicatorului este procedura următoare: se cântăresc aproximativ 0,2000 g de cromat de potasiu pur pentru sepctrofotometrie și se dizolvă în soluție de hidroxid de potasiu 0,05 N într-un balon gradat de 1000 ml și se completează până la gradație. Se iau exact 25 ml din soluția obținută, se transferă într-un balon gradat de 500 ml și se diluează până la gradație, utilizând aceeași soluție de hidroxid de potasiu.

Se măsoară extincția soluției astfel obținute la 275 nm, utilizând soluția de hidroxid de potasiu ca referință. Extincția măsurată cu ajutorul unei cuve de 1 cm ar trebui să fie de 0,200 ± 0,005.

Cuve de cuarț dreptunghiulare, cu capac, adecvate pentru măsurători la lungimi de undă ultravioletă (între 220 și 360 nm) cu o lungime a parcursului optic de 10 mm. Cuvele, umplute cu apă sau cu alt solvent adecvat, nu trebuie să prezinte diferențe între ele mai mari de 0,01 unități de extincție.

Baloane volumetrice gradate, cu o capacitate de 25 ml, clasa A.

Balanță analitică, ce să poată fi citită cu o precizie de 0,0001 g.

REACTIVI

Pe durata analizei, dacă nu se specifică altfel, se utilizează numai reactivi de puritate analitică recunoscută și apă distilată sau demineralizată sau apă de puritate echivalentă.

Solventul: Izooctan (2,2,4-trimetilpentan) pentru măsurătorile la 232 nm și 268 nm și ciclohexan pentru măsurători la 232 nm și 270 nm, având o absorbanță mai mică de 0,12 la 232 nm și mai mică de 0,05 la 270 nm în raport cu apa distilată, măsurată într-o cuvă de 10 mm.

MOD DE LUCRU

Proba trebuie să fie perfect omogenă și lipsită de impurități în suspensie. În caz contrar, aceasta trebuie să fie filtrată printr-un filtru de hârtie la o temperatură de aproximativ 30 °C.

Se cântăresc aproximativ 0,25 g (cu o precizie de 1 mg) din proba astfel preparată într-un balon gradat de 25 ml, se completează până la gradație cu solventul prescris și se omogenizează. Soluția obținută trebuie să fie perfect limpede. În cazul în care soluția ar prezenta opalescență sau turbiditate, se filtrează rapid printr-un filtru de hârtie.

NOTĂ: în general, o masă de 0,25-0,30 g este suficientă pentru măsurarea absorbanței uleiului de măsline virgin și extravirgin la 268 nm și la 270 nm. Pentru măsurători la 232 nm, este necesară o probă de 0,05 g, fiind preparate de obicei două soluții diferite. Pentru măsurători ale absorbanței uleiurilor din resturi de măsline, a uleiurilor rafinate de măsline și a uleiurilor modificate de măsline, este de obicei necesară o proporție mai redusă din probă, de exemplu 0,1 g, ca urmare a absorbanței mai ridicate.

Dacă este necesar, se aplică o corecție a referinței (între 220 și 290 nm) cu solvent din ambele cuve de cuarț (probă și referință), apoi se umple cuva de cuarț a probei cu soluția de test și se măsoară extincțiile la 232, 268 sau 270 nm în raport cu solventul utilizat ca referință.

Valorile de extincție înregistrate trebuie să fie cuprinse în intervalul 0,1-0,8 sau în intervalul liniarității specrofotometrului care ar trebui verificat. În caz contrar, este necesară repetarea măsurătorilor folosindu-se soluții mai concentrate sau mai diluate, după caz.

După măsurarea absorbanței la 268 sau 270 nm, se măsoară absorbanța la λmax, λmax + 4 și λmax – 4. Aceste valori ale absorbanței sunt utilizate pentru a determina variația extincției specifice (ΔΚ).

NOTĂ: se consideră că λmax este 268 nm pentru izooctanul utilizat ca solvent și 270 nm pentru ciclohexan.

EXPRIMAREA REZULTATELOR

Se înregistrează extincțiile specifice (coeficienții de extincție) la diferitele lungimi de undă, calculate după cum urmează:

unde:

Rezultatele sunt exprimate cu două decimale.

Variația extincției specifice (ΔΚ)

Variația valorii absolute a extincției (ΔΚ) este dată de:

unde Km reprezintă extincția specifică la lungimea de undă corespunzătoare absorbției maxime de 270 nm pentru ciclohexan și de 268 nm, în funcție de solventul utilizat.

Rezultatele sunt exprimate cu două decimale.

ANEXA X

ANEXA X

DETERMINAREA ESTERILOR METILICI AI ACIZILOR GRAȘI PRIN CROMATOGRAFIE ÎN FAZĂ GAZOASĂ

DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta anexă oferă orientări privind determinarea prin cromatografie în fază gazoasă a acizilor grași liberi și legați din grăsimile și uleiurile vegetale în urma conversiei lor în esteri metilici ai acizilor grași (EMAG).

Acizii grași legați ai triacilglicerolilor (TAG) și, în funcție de metoda de esterificare, acizii grași liberi sunt convertiți în esteri metilici ai acizilor grași (EMAG), care sunt determinați prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.

Metoda descrisă în prezenta anexă permite determinarea esterilor metilici ai acizilor grași de la C12 la C24, inclusiv a esterilor metilici ai acizilor grași saturați, cis și trans mononesaturați și cis și trans polinesaturați.

PRINCIPIU

Cromatografia în fază gazoasă este utilizată pentru analiza cantitativă a esterilor metilici ai acizilor grași. Esterii metilici ai acizilor grași se prepară în conformitate cu partea A. Aceștia sunt injectați și vaporizați în injector. Separarea esterilor metilici ai acizilor grași se realizează pe coloane analitice cu polaritate și lungime specifice. Un detector cu ionizare în flacără (FID) este utilizat pentru detectarea esterilor metilici ai acizilor grași. Condițiile pentru analiză sunt indicate în partea B.

Hidrogenul sau heliul se poate utiliza ca gaz purtător (faza mobilă) în cromatografia în fază gazoasă a esterilor metilici ai acizilor grași cu detector cu ionizare în flacără. Hidrogenul accelerează separarea și oferă vârfuri mai clare. Faza staționară este un strat microscopic al unei pelicule subțiri de lichid pe o suprafață solidă inertă din silice topită.

Pe măsură ce trec prin coloana capilară, compușii volatilizați analizați interacționează cu filmul fazei staționare de pe suprafața interioară a coloanei. Ca urmare a acestei interacțiuni între diferiți compuși, ei eluează la momente diferite, un astfel de moment purtând denumirea de timp de retenție a compusului pentru un set dat de parametri de analiză. Comparația timpilor de retenție este utilizată pentru identificarea diferiților compuși.

PARTEA A

PREPARAREA ESTERILOR METILICI AI ACIZILOR GRAȘI DIN ULEIUL DE MĂSLINE ȘI DIN ULEIUL DIN RESTURI DE MĂSLINE

DOMENIUL DE APLICARE

Această parte descrie prepararea esterilor metilici ai acizilor grași. Ea include metode pentru prepararea esterilor metilici ai acizilor grași din uleiurile de măsline și din uleiurile din resturi de măsline.

SFERA DE APLICARE

Prepararea esterilor metilici ai acizilor grași din uleiurile de măsline și din uleiurile din resturi de măsline se realizează prin transesterificarea cu soluție metanolică de hidroxid de potasiu la temperatura camerei. Necesitatea de purificare a probei anterior transesterificării depinde de conținutul de acizi grași liberi al probei și de parametrul analitic care trebuie determinat; se poate alege în funcție de tabelul următor:

METODOLOGIE

Transesterificarea cu soluție metanolică de hidroxid de potasiu la temperatura camerei.

Principiu

Esterii metilici se formează prin transesterificare cu hidroxid de potasiu metanolic ca o etapă intermediară înainte de a avea loc saponificarea.

Reactivi

Metanol cu un conținut maxim de apă de 0,5 % (m/m).

Hexan, de calitate cromatografică.

Heptan, de calitate cromatografică.

Dietil eter, stabilizat pentru analiză.

Acetonă, de calitate cromatografică.

Solvent de eluare pentru purificarea uleiului prin cromatografie în coloană/extracție în fază solidă (SPE), amestec hexan/dietil eter 87/13 (v/v).

Hidroxid de potasiu, soluție metanolică de aproximativ 2M: se dizolvă 11,2 g de hidroxid de potasiu în 100 ml de metanol.

Cartușe de silicagel, 1 g (6 ml), pentru extracție în fază solidă.

Aparatură

Eprubete cu dop filetat (5 ml volum), cu capac prevăzut cu o îmbinare cu PTFE.

Pipete gradate sau automate, 2 ml și 0,2 ml.

Purificarea probelor de ulei

Când este necesar, probele vor fi purificate prin trecerea uleiului printr-un cartuș de silicagel pentru extracție în fază solidă. Un cartuș de silicagel (3.1.2.8) este plasat într-un aparat de eluare sub vid și se spală cu 6 ml de hexan (3.1.2.2); spălarea se realizează fără vid. Apoi se încărcă pe coloană o soluție de ulei (aproximativ 0,12 g) în 0,5 ml de hexan (3.1.2.2). Soluția este trasă în jos și eluată apoi cu 10 ml de hexan/dietil eter (87:13 v/v) (3.1.2.6). Eluatele combinate sunt omogenizate și împărțite în două volume similare. O parte alicotă se evaporă până la uscare într-un evaporator rotativ la presiune scăzută și la temperatura camerei. Se dizolvă reziduul în 1 ml de heptan și soluția este pregătită pentru analiza acizilor grași prin cromatografie în fază gazoasă. A doua parte alicotă se evaporă, iar reziduul se dizolvă în 1 ml de acetonă pentru analiza trigliceridelor prin HPLC, dacă este necesar.

Procedură

Într-o eprubetă cu dop filetat de 5 ml (3.1.3.1), se cântărește o probă de ulei de aproximativ 0,1 g. Se adaugă 2 ml de heptan (3.1.2.2) și se agită. Se adaugă 0,2 ml din soluția de hidroxid de potasiu metanolic (3.1.2.7), se așază capacul prevăzut cu o îmbinare cu PTFE, se strânge capacul și se agită energic timp de 30 de secunde. Se lasă să se stratifice până când devine limpede soluția de deasupra. Se decantează stratul superior care conține esterii metilici. Soluția de heptan este pregătită pentru injectare în cromatograful în fază gazoasă. Se recomandă ca soluția să fie păstrată la frigider până la analiza cromatografică în fază gazoasă. Nu se recomandă depozitarea soluției pentru o perioadă mai mare de 12 ore.

PARTEA B

ANALIZA ESTERILOR METILICI AI ACIZILOR GRAȘI PRIN CROMATOGRAFIE ÎN FAZĂ GAZOASĂ

DOMENIUL DE APLICARE

Această parte oferă orientări generale pentru aplicarea cromatografiei în fază gazoasă cu coloană capilară pentru a se determina compoziția calitativă și cantitativă a unui amestec de esteri metilici ai acizilor grași obținut conform metodei specificate în partea A.

Această parte nu este aplicabilă acizilor grași polimerizați.

REACTIVI

Gaz purtător

Gaz inert (heliu sau hidrogen), complet uscat și cu un conținut de oxigen mai mic 10 mg/kg.

Hidrogenul poate dubla viteza de analiză, însă este periculos. Există dispozitive de securitate.

Gaze auxiliare

Hidrogen (cu puritate ≥ 99,9 %) care nu conține impurități organice.

Aer sau oxigen care nu conține impurități organice.

Azot (cu puritate > 99 %).

Produse de etalonare

Amestec de esteri metilici ai acizilor grași puri sau de esteri metilici ai unei substanțe grase cu compoziție cunoscută, de preferat similară cu cea a substanței grase de analizat. Izomerii cis și trans ai esterilor metilici octadecenoici, octadecadienoici și octadecatrienoici sunt utili pentru identificarea izomerilor trans ai acizilor nesaturați.

Ar trebui să se facă eforturi pentru a se preveni oxidarea acizilor grași polinesaturați.

APARATURĂ

Instrucțiunile se referă la aparatele obișnuite de cromatografie în fază gazoasă care utilizează coloane capilare și un detector cu ionizare prin flacără.

Cromatograful în fază gazoasă

Cromatograful în fază gazoasă trebuie să cuprindă următoarele elemente.

Dispozitiv de injecție

Se utilizează un dispozitiv de injecție cu coloane capilare, caz în care dispozitivul de injecție trebuie să fie conceput special pentru utilizarea cu astfel de coloane. Poate fi cu divizare sau fără, cu injector pe coloană rece.

Cuptor

Cuptorul trebuie să fie în măsură să aducă coloana capilară la o temperatură de minimum 260 °C și să mențină temperatura dorită în limita a 0,1 °C. Această ultimă cerință este importantă îndeosebi atunci când se utilizează un tub de silice topită.

Utilizarea unui aparat de încălzit echipat cu un programator de temperatură este recomandată în toate cazurile, în special în prezența acizilor grași cu mai puțin de 16 atomi de carbon.

Coloană capilară

Tub din material inert față de substanțele de analizat (în general de sticlă sau de silice topită). Diametrul intern trebuie să fie cuprins între 0,20 și 0,32 mm. În interior, trebuie să suporte tratamente adecvate (prepararea stării de suprafață, inactivarea) înainte de a primi filmul fazei staționare. O lungime de 60 m este suficientă pentru acizii grași și pentru izomerii cis și trans ai acizilor grași.

Fază staționară, coloanele de tip polisiloxani polari (cianopropil-silicon) grefate (reticulate) sunt adecvate.

Polisiloxanii polari riscă să creeze dificultăți în identificarea și separarea acidului linolenic și a acizilor C20.

Grosimile filmului trebuie să fie reduse: 0,1-0,2 μm.

Montajul și condiționarea coloanei

Se respectă precauțiile obișnuite de montare a coloanelor capilare, adică dispunerea coloanei în cuptor (suport), alegerea și montarea îmbinărilor (etanșeitate), poziționarea extremităților coloanei în injector și detectorul (reducerea volumelor moarte). Se pune coloana sub un flux de gaz purtător [de exemplu, 0,3 bar (30 kPa) pentru o coloană de 25 de metri lungime și cu un diametru interior de 0,3 mm].

Se condiționează coloana prin programarea temperaturii cuptorului la 3 °C/minut de la temperatura ambiantă până la o temperatură cu 10 °C sub limita de descompunere a fazei staționare. Se menține cuptorul la această temperatură timp de o oră, până la stabilizarea liniei de bază. Se revine la 180 °C pentru a se lucra în condiții izoterme.

În comerț sunt disponibile coloane precondiționate adecvate.

Detector cu ionizare în flacără și convertor-amplificator

Seringa

Seringa trebuie să aibă o capacitate de maximum 10 μl și să fie gradată la 0,1 μl.

Sistem de culegere a datelor

Sistemul de culegere a datelor, conectat online cu detectoare și utilizat cu un program software adecvat pentru integrarea și normalizarea vârfurilor.

MOD DE LUCRU

Operațiunile descrise la punctele 4.1-4.3 vizează utilizarea unui detector cu ionizare în flacără.

Condiții de testare

Alegerea condițiilor optime de operare pentru coloane capilare

Datorită eficienței și permeabilității coloanelor capilare, separarea constituenților și durata analizei sunt dependente în mare măsură de debitul gazului purtător în coloană. Prin urmare, va fi necesar să se optimizeze condițiile de operare prin ajustarea acestui parametru (sau pur și simplu pierderea încărcăturii din capul coloanei), în funcție de ceea ce se dorește, adică îmbunătățirea separărilor sau realizarea rapidă a analizei.

Următoarele condiții s-au dovedit adecvate pentru separarea esterilor metilici ai acizilor grași (C4-C26). Exemple de cromatograme sunt prezentate în apendicele B:

Determinarea rezoluției (a se vedea apendicele A)

Se calculează rezoluția, R, a două vârfuri vecine I și II, cu ajutorul formulei:

R = 2 × [(dr(II) – dr(I))/(ω(I) + ω(II))] or R = 2 × [(tr(II) – tr(I))/(ω(I) + ω(II))] (USP) (United States Pharmacopeia),

sau

R = 1,18 × [(tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))] (EP, BP, JP, DAB) [JP (Japanese Pharmacopeia), EP (Pharmacopée Européenne), BP (British Pharmacopeia)],

unde:

dr(I) este distanța de retenție a vârfului I;

dr(II) este distanța de retenție a vârfului II;

tr(I) este timpul de retenție al vârfului;

tr(II) este timpul de retenție al vârfului II;

ω(I) este lățimea bazei vârfului I;

ω(II) este lățimea bazei vârfului II;

ω0,5 este lățimea vârfului compusului specificat, la jumătatea înălțimii vârfului;

Dacă ω(I) ≈ ω(II), R se calculează cu ajutorul următoarelor formule:

R = (dr(II) – dr(I))/ω = (dr(II) – dr(I))/4σ

unde:

σ este deviația standard (a se vedea apendicele A, figura 1).

Dacă distanța dr dintre cele două vârfuri dr(II) – dr(I) este egală cu 4σ, factorul de rezoluție R = 1.

Dacă două vârfuri nu sunt separate complet, tangentele la punctele de inflexiune ale celor două vârfuri se intersectează în punctul C. Pentru a se separa complet cele două vârfuri, distanța dintre cele două vârfuri trebuie să fie egală cu:

dr(II) – dr(I) = 6 σ de unde R = 1,5 (a se vedea apendicele A, figura 3).

EXPRIMAREA REZULTATELOR

Analiza cantitativă

Se identifică vârfurile esterului metilic al probei din cromatograma din apendicele B figura 1, dacă este necesar prin interpolare, sau prin comparație cu cele ale amestecurilor etalon de esteri metilici (în conformitate cu punctul 2.3).

Analiza cantitativă

Determinarea compoziției

Se calculează fracțiunea de masă wi a esterilor metilici ai acizilor grași individuali, exprimată în procentaj de masă de esteri metilici, după cum urmează:

Mod de calcul

Caz general

Se calculează conținutul unui constituent dat i, exprimat în procentaj de masă de esteri metilici, prin determinarea procentajului reprezentat de aria vârfului corespunzător în raport cu suma ariilor tuturor vârfurilor, cu ajutorul următoarei formule:

wi = (Ai/ΣA) × 100,

unde:

Ai este aria valorii de vârf a esterilor metilici ai acizilor grași individuali i;

ΣA este suma ariilor totalității valorilor de vârf ale tuturor esterilor metilici ai acizilor grași individuali.

Rezultatele sunt exprimate cu două decimale.

Pentru grăsimi și uleiuri, fracția masică a esterilor metilici ai acizilor grași este egală cu fracția masică a triacilglicerolilor în grame per 100 g. Pentru cazurile în care această ipoteză nu este permisă, a se vedea 5.2.2.2.

Utilizarea factorilor de corecție

În anumite cazuri, de exemplu în prezența acizilor grași cu mai puțin de opt atomi de carbon sau a acizilor cu funcții secundare, ariile se corectează cu factori de corecție specifici (Fci). Acești factori se determină pentru fiecare instrument. În acest scop, se utilizează materiale de referință adecvate, cu compoziție de acizi grași certificată în intervalul corespunzător.

Acești factori de corecție nu sunt identici cu factorii de corecție teoretici FID, care sunt specificați în apendicele A, întrucât includ, de asemenea, performanța sistemului de injecție etc. Cu toate acestea, în cazul unor diferențe mai mari, întregul sistem ar trebui verificat din punctul de vedere al performanței.

Pentru acest amestec etalon, procentajul în masă al esterilor metilici ai acizilor grași i este dat de formula:

wi = (mi/Σm) × 100,

unde

mi este masa esterilor metilici ai acizilor grași i în amestecul etalon;

Σm este suma maselor diverșilor constituenți, precum esterii metilici ai acizilor grași, ai amestecului etalon.

Pornind de la cromatograma amestecului etalon, se calculează procentajul ca arie al esterilor metilici ai acizilor grași i, astfel:

wi = (Ai/ΣA) × 100,

unde:

Ai este aria esterilor metilici ai acizilor grași i în amestecul etalon;

ΣA este suma tuturor ariilor ale tuturor esterilor metilici ai acizilor grași din amestecul etalon.

Factorul de corecție Fc este deci:

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm).

Pentru probă, procentajul ca masă al fiecărui ester metilic al acizilor grași i este:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai).

Rezultatele sunt exprimate cu două decimale.

Valoarea calculată corespunde procentajului în masă al acidului gras individual calculat ca triacilgliceroli per 100 g de substanță grasă.

Utilizarea unui etalon intern

În anumite analize (de exemplu, când nu sunt cuantificați toți acizii grași, precum atunci când acizii în C4 și în C6 sunt prezenți alături de acizii în C16 și C18, sau când este necesară determinarea cantității absolute de acizi grași dintr-o probă), este necesară utilizarea unui etalon intern. Acizii grași în C5, C15 sau C17 sunt utilizați în mod frecvent. Se determină factorul de corecție al etalonului intern (dacă este necesar).

Procentajul în masă al compusului i, exprimat în esteri metilici, este dat în continuare de formula:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS),

unde:

Ai este aria esterilor metilici ai acizilor grași i;

AIS este aria etalonului intern;

Fi este factorul de corecție al acidului gras i, exprimat ca EMAG;

FIS este factorul de corecție al etalonului intern;

m este masa probei de testare, în miligrame

mIS este masa etalonului intern, în miligrame.

Rezultatele sunt exprimate cu două decimale.

PROCESUL-VERBAL DE TESTARE

Procesul-verbal de testare trebuie să specifice metodele utilizate pentru prepararea esterilor metilici și pentru analiza prin cromatografie în fază gazoasă. Acesta trebuie să menționeze, de asemenea, toate detaliile de operare nespecificate în prezenta metodă standard sau considerate opționale, împreună cu detalii privind eventualele incidente care ar fi putut influența rezultatele.

Procesul-verbal de testare trebuie să includă toate informațiile necesare pentru identificarea completă a probei.

PRECIZIA

Rezultatele testului între laboratoare

Detaliile unui test între laboratoare privind precizia metodei sunt prezentate în anexa C la standardul IOC/T.20/Doc. nr. 33. Valorile derivate din acest test între laboratoare pot să nu fie aplicabile intervalelor de concentrație și matricelor, altele decât cele prezentate.

Repetabilitatea

Diferența absolută dintre două rezultate independente ale unui singur test, obținute prin aceeași metodă pe o substanță de testare identică, în același laborator, de către același operator, folosind același echipament la un interval scurt de timp, va fi mai mare în cel mult 5 % dintre cazuri decât valoarea R indicată în tabelele 1-14 din anexa C la standardul IOC/T.20/Doc. nr. 33.

Reproductibilitatea

Diferența absolută dintre două rezultate ale unui singur test, obținute prin aceeași metodă pe o substanță de testare identică, în laboratoare diferite, cu operatori diferiți, folosind echipamente diferite, va fi mai mare în cel mult 5 % dintre cazuri decât valoarea R indicată în tabelele 1-14 din anexa C la standardul IOC/T.20/Doc. nr. 33.

dr(I) este distanța de retenție a vârfului I;

dr(II) este distanța de retenție a vârfului II;

tr(I) este timpul de retenție al vârfului;

tr(II) este timpul de retenție al vârfului II;

ω(I) este lățimea bazei vârfului I;

ω(II) este lățimea bazei vârfului II;

ω0,5 este lățimea vârfului compusului specificat, la jumătatea înălțimii vârfului;

Ai este aria valorii de vârf a esterilor metilici ai acizilor grași individuali i;

ΣA este suma ariilor totalității valorilor de vârf ale tuturor esterilor metilici ai acizilor grași individuali.

mi este masa esterilor metilici ai acizilor grași i în amestecul etalon;

Σm este suma maselor diverșilor constituenți, precum esterii metilici ai acizilor grași, ai amestecului etalon.

Ai este aria esterilor metilici ai acizilor grași i în amestecul etalon;

ΣA este suma tuturor ariilor ale tuturor esterilor metilici ai acizilor grași din amestecul etalon.

Ai este aria esterilor metilici ai acizilor grași i;

AIS este aria etalonului intern;

Fi este factorul de corecție al acidului gras i, exprimat ca EMAG;

FIS este factorul de corecție al etalonului intern;

m este masa probei de testare, în miligrame

mIS este masa etalonului intern, în miligrame.

Apendicele A

Apendicele A

Figura 1

ω0,5 reprezintă lățimea la jumătatea înălțimii triunghiului (ABC) și b reprezintă lățimea la jumătatea înălțimii triunghiului (NPM).

Apendicele B

Apendicele B

Figura 1

Profilul cromatografic în fază gazoasă obținut prin metoda de metilare la rece din ulei din resturi de măsline

Vârfurile cromatografice corespund esterilor metilici și etilici, cu excepția cazurilor în care există indicații contrare.

ANEXA XIDETERMINAREA CONȚINUTULUI DE SOLVENȚI HALOGENAȚI VOLATILI ÎN ULEIUL DE MĂSLINE

ANEXA XI

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE SOLVENȚI HALOGENAȚI VOLATILI ÎN ULEIUL DE MĂSLINE

PRINCIPIU

Analiză prin cromatografie în fază gazoasă cu tehnica spațiului de cap (tehnica head space).

APARATURĂ

Aparat de cromatografie în fază gazoasă, dotat cu un detector cu captură de electroni (ECD).

Aparatură pentru spațiul de cap (tehnica head space).

Coloană de cromatografie în fază gazoasă din sticlă cu o lungime de 2 metri și un diametru de 2 mm, fază staționară. OV 101 la 10 % sau echivalent, impregnând un pământ cu diatomit calcinat, spălat cu acizi și silanizat, cu granulometrie de 80–100 Mesh.

Gaz vector și gaz auxiliar: azot pentru cromatografie în fază gazoasă, adaptată la detectarea prin captură de electroni.

Flacoane de sticlă de 10–15 mm dotate cu o garnitură de teflon și cu un dop de aluminiu și un orificiu care permite prelevarea cu seringa.

Pensă cu închidere ermetică.

Seringă pentru gaz de 0,5–2 ml.

REACTIVI

Standard: solvenți halogenați volatili cu un grad de puritate adecvat utilizării cromatografiei în fază gazoasă.

PROCEDURA DE ANALIZĂ

Se cântăresc cu grijă aproximativ 3 g de ulei într-un flacon de sticlă (a nu se reutiliza), se astupă flaconul până la închiderea ermetică. Se introduce flaconul într-un termostat la 70 °C timp de 1 oră. Se prelevează cu precizie cu ajutorul seringii un volum de 0,2–0,5 ml din tehnica head space. Se injectează în coloana aparatului de cromatografie în fază gazoasă reglat după cum urmează:

temperatura injectorului: 150 °C;

temperatura coloanei: 70–80 °C;

temperatura detectorului: 200–250 °C.

Pot fi utilizate și alte temperaturi, cu condiția ca rezultațele să fie echivalente.

Soluții etalon. Se prepară soluții etalon, utilizând ulei rafinat fără urmă de solvenți, cu concentrații variabile între 0,05 și 1 miligram pe kilogram și în raport cu conținutul presupus al mostrei. Diluarea eventuală trebuie să se efectueze cu pentan.

Evaluarea cantitativă. Se face raportul între suprafețele sau înălțimile valorilor de vârf ale mostrei și ale soluției etalon cu concentrația presupusă cea mai apropiată. În cazul în care abaterea relativă este mai mare de 10 %, trebuie să se refacă analiza prin compararea cu o nouă soluție etalon până când concentrația va respecta abaterea relativă menționată anterior. Conținutul este stabilit pe baza unei medii de injecții elementare.

Exprimarea rezultatelor. Rezultatele sunt exprimate în miligrame pe kilogram (ppm). Limita de detectare a metodei este de 0,01 mg pe kilogram.

temperatura injectorului: 150 °C;

temperatura coloanei: 70–80 °C;

temperatura detectorului: 200–250 °C.

ANEXA XII

ANEXA XII

METODA CONSILIULUI OLEICOL INTERNAȚIONAL PENTRU EVALUAREA ORGANOLEPTICĂ A ULEIURILOR DE MĂSLINE VIRGINE

SCOPUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Regulamentul (UE) nr. 1308/2013 al Parlamentului European și al Consiliului din 17 decembrie 2013 de instituire a unei organizări comune a piețelor produselor agricole și de abrogare a Regulamentelor (CEE) nr. 922/72, (CEE) nr. 234/79, (CE) nr. 1037/2001 și (CE) nr. 1234/2007 ale Consiliului (JO L 347, 20.12.2013, p. 671).

Metoda prezentată nu se aplică decât uleiurilor de măsline virgine și clasificării sau etichetării acestora în funcție de intensitatea defectelor percepute și a gustului fructat, determinate de un grup de degustători selecționați, formați și monitorizați, constituiți într-o comisie.

Standardele COI menționate în prezenta anexă se utilizează în ultima versiune disponibilă.

VOCABULARUL GENERAL DE BAZĂ AL ANALIZEI SENZORIALE

A se vedea standardul IOC/T.20/Doc. nr. 4 Analiza senzorială: Vocabular general de bază

VOCABULAR SPECIFIC

Atribute negative

Stătut/de drojdie: aromă caracteristică uleiului extras din măsline strânse sau depozitate în condiții de natură să determine un stadiu avansat de fermentare anaerobă sau uleiului rămas în contact cu depunerile rezultate în urma decantării, care au suferit, de asemenea, un proces de fermentare anaerobă în containere și cuve.

Mucegăit/umed/de pământ: Aromă caracteristică uleiului de măsline obținut din fructe atacate de mucegaiuri și de drojdii, ca rezultat al depozitării acestora timp de mai multe zile în condiții de umiditate sau uleiului obținut din măsline care au fost culese cu pământ sau acoperite cu noroi și care nu au fost spălate.

De vin/oțetit/acid/acru: aromă caracteristică a anumitor uleiuri care amintește de vin sau de oțet. Această aromă se datorează în principal unui proces de fermentare aerobă a măslinelor sau a resturilor de pastă de măsline de pe rogojini care nu au fost probabil spălate corespunzător, ceea ce a condus la formarea de acid acetic, de acetat de etil și de etanol.

Rânced: aromă a uleiurilor care au fost supuse unui proces intens de oxidare.

Măsline înghețate (lemn umed): aromă caracteristică uleiurilor extrase din măsline care au suferit de pe urma înghețului în copaci.

Alte atribute negative

Atribute pozitive

Terminologie opțională în scopul etichetării

La cerere, președintele comisiei poate atesta faptul că uleiurile evaluate respectă definițiile și intervalele care corespund doar termenilor următori, în funcție de intensitatea și de percepția atributelor.

Atributele pozitive (fructat, amar și picant): în funcție de intensitatea percepției:

robust, atunci când mediana atributului este mai mare decât 6,0;

mediu, atunci când mediana atributului este mai mare decât 3,0 și mai mică sau egală cu 6,0;

delicat, atunci când mediana atributului este mai mică sau egală cu 3,0.

Lista termenilor în funcție de intensitatea percepției:

PAHAR PENTRU DEGUSTAREA ULEIURILOR

A se vedea standardul IOC/T.20/Doc. nr. 5, Pahar pentru degustarea uleiurilor.

SALA DE DEGUSTARE

A se vedea standardul IOC/T.20/Doc. nr. 6, Ghid pentru instalarea unei săli de degustare.

ACCESORII

Fiecare cabină trebuie să fie dotată cu următoarele accesorii, care să se afle la îndemâna degustătorului pentru a-i permite să-și îndeplinească sarcina în mod corespunzător:

pahare (standardizate) care conțin probele, identificate cu un număr de cod, acoperite cu o sticlă de ceas și păstrate la 28 °C ± 2 °C;

foaia de profil (a se vedea figura 1), pe suport de hârtie sau în format electronic, care îndeplinește condițiile privind foaia de profil, împreună cu instrucțiunile pentru utilizarea sa în cazul în care este necesar;

pix sau cerneală indelebilă;

tăvi cu felii de mere și/sau apă, apă gazoasă și/sau pesmeți;

un pahar cu apă la temperatura ambiantă;

o foaie care reamintește normele generale enumerate la punctele 8.4 și 9.1.1;

scuipători.

PREȘEDINTELE COMISIEI ȘI DEGUSTĂTORII

Președintele comisiei

Președintele comisiei trebuie să aibă o pregătire corespunzătoare și să fie un expert în toate tipurile de uleiuri pe care le va degusta în timpul testării. El este personalitatea de bază din comisie și are responsabilitatea organizării și funcționării acesteia.

Activitățile președintelui comisiei necesită ca acesta să aibă o formare de bază în ceea ce privește instrumentele de analiză senzorială, aptitudini senzoriale, meticulozitate la pregătirea, organizarea și desfășurarea testelor, precum și capacitățile și răbdarea necesare pentru a planifica și efectua testele în mod științific.

El este singura persoană responsabilă cu selectarea, formarea și monitorizarea degustătorilor, pentru a garanta nivelul lor de aptitudini. El este, prin urmare, responsabil cu evaluarea degustătorilor, care trebuie întotdeauna să fie obiectivă și pentru care trebuie să dezvolte proceduri specifice bazate pe teste și pe criterii solide de acceptare și de respingere. A se vedea standardul IOC/T.20/Doc. nr. 14, Ghid pentru selectarea, formarea și monitorizarea degustătorilor calificați de ulei de măsline virgin.

Președintele comisiei este responsabil de performanța comisiei și, prin urmare, de evaluarea sa, în legătură cu care trebuie să furnizeze dovezi fiabile și obiective. În orice caz, trebuie să dovedească, în orice moment, că metoda și degustătorii fac obiectul unor controale. Se recomandă calibrarea periodică a comisiei (IOC/T.20/Doc. nr. 14, punctul 5).

El deține responsabilitatea finală pentru ținerea evidențelor comisiei. Evidențele trebuie să fie întotdeauna trasabile, să respecte cerințele de certitudine și de calitate stabilite în standardele internaționale privind analiza senzorială și să asigure întotdeauna anonimitatea probelor.

El este responsabil cu inventarierea aparaturii și a echipamentelor și trebuie să se asigure că acestea, care sunt necesare pentru a respecta specificațiile prezentei metode, sunt curățate și întreținute în mod corespunzător, păstrând dovezi scrise în această privință. De asemenea, el este responsabil cu respectarea condițiilor de testare.

El are responsabilitatea recepționării și depozitării probelor în momentul în care ajung la laborator, precum și pe cea a depozitării lor după testare. În acest context, el se asigură în permanență că probele rămân anonime și că sunt depozitate corespunzător, iar în acest scop trebuie să elaboreze proceduri scrise pentru a garanta că întregul proces este trasabil și sigur.

În plus, este responsabil cu pregătirea, alocarea unui cod și prezentarea probelor către degustători în conformitate cu un protocol experimental corespunzător care respectă protocoalele prestabilite și, de asemenea, răspunde de colectarea și prelucrarea statistică a datelor obținute de degustători.

El este responsabil cu elaborarea și redactarea oricăror alte proceduri care ar putea fi necesare pentru a completa prezentul standard și pentru a garanta funcționarea corespunzătoare a comisiei.

El trebuie să caute modalități de comparare a rezultatelor comisiei cu cele obținute de alte comisii care efectuează analiza uleiului de măsline virgin, pentru a stabili dacă comisia funcționează în mod corespunzător.

Președintele comisiei are datoria de a-i motiva pe membrii comisiei de degustători prin promovarea interesului, a curiozității și a spiritului competitiv în rândurile acestora. În acest sens, li se recomandă să asigure un bun flux bidirecțional de informații cu membrii comisiei, care trebuie să fie informați în privința tuturor sarcinilor pe care le efectuează, precum și a rezultatelor obținute. În plus, el nu trebuie să-și facă publică opinia și va evita situația în care eventualii lideri își impun propriile criterii celorlalți degustători.

El îi convoacă din timp pe degustători și răspunde întrebărilor acestora cu privire la desfășurarea testelor, dar nu le sugerează opinii referitoare la probă.

Președintele adjunct al comisiei

Din motive întemeiate, președintele comisiei poate fi înlocuit cu un președinte al comisiei adjunct care poate prelua sarcinile legate de efectuarea testelor. Acest înlocuitor trebuie să dețină toate competențele necesare solicitate unui președinte al comisiei.

Degustătorii

Persoanele care au calitatea de degustători în testarea organoleptică a uleiurilor de măsline trebuie să facă acest lucru în mod voluntar. Prin urmare, se recomandă depunerea unei cereri scrise de către candidați. Candidații sunt selecționați, formați și monitorizați de către președintele comisiei, în conformitate cu capacitatea lor de a face distincția între probe similare, ținând cont de faptul că precizia lor se va îmbunătăți ca urmare a formării.

Degustătorii trebuie să se comporte ca adevărați observatori senzoriali, lăsându-și deoparte gusturile personale și raportând doar senzațiile pe care le percep. În acest sens, ei trebuie să-și desfășoare întotdeauna activitatea în tăcere, într-un mod relaxat și lipsit de grabă, acordând o atenție senzorială maximă probei pe care o degustă.

Pentru fiecare test sunt necesari între 8 și 12 degustători, dar trebuie să se prevadă câțiva degustători suplimentari care să poată fi folosiți în cazul unei eventuale absențe.

CONDIȚIILE DE TESTARE

Prezentarea probei

Proba de ulei pentru analiză este prezentată în pahare de testare standardizate care respectă standardul IOC/T.20/Doc. nr. 5, Pahar pentru degustarea uleiurilor.

Paharul conține 14-16 ml de ulei, sau între 12,8 și 14,6 g dacă probele sunt cântărite, și se acoperă cu o sticlă de ceas.

Fiecare pahar trebuie să fie marcat cu un cod format din cifre sau o combinație de litere și de cifre alese la întâmplare. Marcarea codului se face cu ajutorul unui sistem nemirositor.

Temperatura de testare și cea a probelor

Probele de ulei destinate degustării trebuie să fie menținute în pahare la 28 °C ± 2 °C pe toată durata testării. Această temperatură a fost reținută pentru că ușurează observarea diferențelor organoleptice prin comparație cu temperatura ambiantă și pentru că la temperaturi mai scăzute compușii aromatici caracteristici acestor uleiuri sunt slab volatili, în timp ce temperaturile mai ridicate duc la formarea de compuși volatili caracteristici uleiurilor încălzite. A se vedea standardul IOC/T.20/Doc. nr. 5 Pahar pentru degustarea uleiurilor pentru metoda care trebuie utilizată pentru încălzirea probelor aflate în pahar.

Sala de degustare trebuie să aibă o temperatură de 20 ° - 25 ° C (a se vedea standardul IOC/T.20/Doc. nr. 6).

Orarul de degustare

Pentru degustarea uleiurilor, orele optime de lucru sunt cele de dimineață: s-a dovedit că există perioade optime de percepție a gustului și a mirosului în timpul zilei. Înainte de mese sensibilitatea gustativ-olfactivă crește, în timp ce după mese percepția gustativ-olfactivă scade.

Cu toate acestea, criteriul menționat nu trebuie absolutizat în cazul în care foamea poate să distragă atenția degustătorilor, ceea ce diminuează capacitatea lor de departajare, prin urmare se recomandă ca degustarea să aibă loc dimineața între orele 10 și 12.

Degustători: norme generale de conduită

Următoarele recomandări se referă la comportamentul degustătorilor în timpul degustării.

Atunci când sunt chemați de către președintele comisiei să participe la testul organoleptic, degustătorii trebuie să respecte orarul stabilit, precum și următoarele reguli:

Să se abțină de la fumat și să nu bea cafea cu cel puțin 30 minute înainte de ora stabilită pentru test.

Trebuie să nu folosească parfumuri, produse cosmetice sau un săpunuri al căror miros ar putea să persiste în momentul testului. Trebuie să-și spele mâinile cu un săpun fără miros, apoi să le clătească și să le usuce ori de câte ori este necesar pentru a elimina orice miros.

Să nu mănânce nimic cu cel puțin o oră înaintea degustării.

În cazul unui disconfort fizic, în special dacă le este afectat simțul mirosului sau al gustului sau dacă se află sub efectul unui impact psihologic care îi poate împiedica să se concentreze, degustătorii îl informează pe președintele comisiei pentru ca acesta să îi retragă din testare.

După îndeplinirea celor menționate, degustătorii își ocupă locul în cabina care le-a fost atribuită, într-un mod ordonat și silențios.

Ei trebuie să citească atent instrucțiunile care figurează pe foaia de profil și să înceapă examinarea probei numai după ce sunt pe deplin pregătiți pentru sarcina de îndeplinit (în mod relaxat și lipsit de grabă). În cazul unor nelămuriri, trebuie să se consulte în particular cu președintele comisiei.

Atunci când își îndeplinesc sarcinile, degustătorii păstrează tăcerea.

Telefoanele lor mobile trebuie să fie oprite pe toată durata degustării, pentru a nu afecta concentrația și activitatea colegilor.

PROCEDURA PENTRU EVALUAREA ORGANOLEPTICĂ ȘI CLASAREA ULEIULUI DE MĂSLINE VIRGIN

Tehnica de degustare

Degustătorii iau paharul, ținându-l acoperit cu sticla de ceas, apoi îl înclină ușor și în această poziție îl rotesc complet pentru a umezi interiorul acestuia pe o suprafață cât mai mare. După această operațiune, degustătorii îndepărtează sticla de ceas și miros proba inspirând lent și profund, pentru a evalua uleiul. Durata testului olfactiv nu trebuie să depășească 30 de secunde. Dacă nu au ajuns la nici o concluzie în acest timp, degustătorii fac o scurtă pauză înainte de a trece la o nouă testare.

După efectuarea testului olfactiv, degustătorii evaluează senzațiile bucale (senzații retronazale globale olfactive, gustative și tactile). În acest scop, se ia în gură o cantitate mică de ulei, de aproximativ 3 ml. Este foarte importantă distribuirea uleiului în toată cavitatea bucală, de la partea anterioară a gurii și limbii, trecând prin părțile laterale și partea posterioară, până la vălul palatului și gât, fiind bine cunoscut că gustul și senzațiile tactile sunt percepute cu o intensitate variabilă în funcție de diferitele zone ale limbii, ale palatului și ale gâtului.

Trebuie să se insiste asupra necesității de a răspândi uleiul în cantități suficiente și foarte lent în partea posterioară a limbii până la vălul palatului și gât, atenția degustătorului fiind dirijată spre ordinea apariției stimulilor amar și picant. Dacă nu se procedează astfel, la anumite uleiuri cei doi stimuli pot trece neobservați sau stimulul amar poate fi mascat de stimulul picant.

Inspirațiile scurte și succesive, care lasă aerul să pătrundă prin gură, permit nu numai buna răspândire a probei în toată cavitatea bucală, ci și perceperea pe cale retronazală a compușilor aromatici volatili, prin utilizarea forțată a acestui canal.

N.B. Când degustătorii nu percep atributul fructat dintr-o probă, iar intensitatea atributului de clasare negativ este de 3,5 sau mai mică, președintele comisiei poate decide să ia măsuri pentru ca degustătorii să analizeze proba din nou la temperatura ambiantă (COI/T.20/Doc. Nr. 6/Rev. 1, septembrie 2007, secțiunea 3 – Specificații generale pentru instalarea unei săli de degustare), specificând contextul și conceptul de temperatură ambiantă. Când proba ajunge la temperatura camerei, degustătorii trebuie să o evalueze din nou pentru a verifica doar dacă se percepe atributul fructat. Dacă da, degustătorii trebuie să marcheze intensitatea pe scară.

Senzația tactilă de picant trebuie luată în considerare. În acest scop, se recomandă ingerarea uleiului.

Când se efectuează evaluarea organoleptică a uleiului de măsline virgin, se recomandă evaluarea a maximum patru probe în fiecare sesiune, având cel mult trei sesiuni pe zi, pentru a evita efectul de contrast care ar putea apărea prin degustarea imediată a altor probe.

Având în vedere că degustările succesive sunt afectate de oboseală sau de pierderea acuității, cauzate de degustările precedente, trebuie să se utilizeze un produs capabil să elimine din gură resturile de ulei de la degustarea tocmai efectuată.

Se recomandă utilizarea unei bucățele de măr care, după mestecare, poate fi aruncată în scuipătoare. În continuare, se clătește gura cu puțină apă la temperatura ambiantă. Se lasă să treacă cel puțin 15 minute între sfârșitul unei sesiuni și începutul următoarei.

Utilizarea foii de profil de către degustători

Foaia de profil care trebuie utilizată de către degustători este reprodusă în figura 1 din prezenta anexă.

Degustătorul se poate abține să deguste un ulei atunci când constată pe cale olfactivă directă vreun atribut negativ extrem de intens, notând pe foaia de profil această situație excepțională.

În cazul în care degustătorii percep atribute negative neindicate în secțiunea 4, acestea se înregistrează la rubrica altele, folosindu-se termenul sau termenii care descriu cel mai precis atributele respective.

Utilizarea datelor de către președintele comisiei

Președintele comisiei strânge foile de profil completate de fiecare degustător și trece în revistă intensitățile consemnate pentru diferitele atribute. Dacă identifică vreo anomalie, invită degustătorul să își revizuiască foaia de profil și, dacă este necesar, să repete testul.

Președintele comisiei introduce datele referitoare la evaluarea fiecărui membru al comisiei într-un program informatic de tipul celor prevăzute de standardul IOC/T.20/Doc. nr. 15, în vederea calculării din punct de vedere statistic a rezultatelor analizei, pe baza calculării medianei acestora. A se vedea punctul 9.4 și apendicele la prezenta anexă. Datele pentru o anumită probă se introduc cu ajutorul unei matrice care conține 9 coloane, reprezentând cele 9 atributele senzoriale, și n linii corespunzătoare celor n membri care fac parte din comisie.

Atunci când se percepe un defect care se înregistrează la rubrica altele de către cel puțin 50 % din comisie, președintele comisiei calculează mediana defectului și obține clasarea corespunzătoare.

Valoarea coeficientului de variație robust care definește clasarea (defectul cu cea mai mare intensitate și atributul fructat) trebuie să nu fie mai mare de 20 %.

În caz contrar, președintele comisiei trebuie să repete evaluarea probei respective într-o altă sesiune de degustare.

Dacă această situație este frecventă, se recomandă ca președintele comisiei să ofere degustătorilor o formare specifică suplimentară (IOC/T.20/Doc. nr. 14, punctul 5) și să utilizeze indicele de repetabilitate și indicele de deviație pentru a verifica performanțele degustătorilor (IOC/T.20/Doc. nr. 14, punctul 6).

Clasarea uleiului

Uleiul se clasează în categoriile de mai jos, în funcție de mediana defectelor și de mediana atributului fructat. Mediana defectelor se definește ca mediana defectului perceput cu cea mai mare intensitate. Mediana defectelor și mediana atributului fructat sunt exprimate cu o precizie de o zecimală.

Clasarea uleiului se efectuează prin compararea valorii medianei defectelor și a medianei atributului fructat cu intervalele de referință prezentate în cele ce urmează. Întrucât limitele acestor intervale s-au stabilit ținându-se cont de eroarea metodei, acestea sunt considerate absolute. Pachetele de software permit să se afișeze clasarea într-un tabel de date statistice sau ca grafic.

În cazul uleiului de măsline extravirgin, mediana defectelor este egală cu 0,0, iar mediana atributului fructat este mai mare de 0,0.

În cazul uleiului de măsline virgin, mediana defectelor este mai mare de 0,0 și mai mică sau egală cu 3,5, iar mediana atributului fructat este mai mare de 0,0.

În cazul uleiului de măsline virgin lampant, mediana defectelor depășește 3,5 sau mediana defectelor este mai mică sau egală cu 3,5, iar mediana atributului fructat este egală cu 0,0.

Atunci când mediana atributului amar și/sau a atributului picant depășește 5,0, președintele comisiei trebuie să declare acest lucru pe certificatul de test.

Pentru evaluările care au ca scop monitorizarea conformității, trebuie efectuat un singur test. În cazul contraevaluărilor, analiza trebuie să se desfășoare în duplicat, în sesiuni de testare diferite. Rezultatele analizei duplicat trebuie să fie omogene din punct de vedere statistic (a se vedea punctul 9.5). În caz contrar, proba trebuie analizată din nou de încă două ori. Valoarea finală a medianei atributelor de clasare se va calcula pe baza valorii medii a ambelor mediane.

Criterii pentru acceptarea și respingerea duplicatelor

Pentru a se stabili dacă cele două rezultate ale unei analize în duplicat sunt omogene sau acceptabile din punct de vedere statistic, se utilizează eroarea normalizată, definită în cele ce urmează:

unde Me1 și Me2 sunt medianele celor două duplicate (mai exact, prima și a doua analiză), iar U1 și U2 sunt incertitudinile extinse obținute pentru cele două valori, calculate, după cum se specifică în apendice, astfel:

U1 = c × s* and s* = (CV_rMe_1)100

În cazul incertitudinii extinse, c = 1,96; așadar:

U1 = 0,0196 × CVr × Me1

unde CVr este coeficientul de variație robust.

Pentru a se declara că cele două valori obținute nu sunt diferite din punct de vedere statistic, En trebuie să fie egală cu 1,0 sau mai mică.

Apendice

Metoda de calcul al medianei și al intervalelor de încredere

Mediana

Mediana se definește ca numărul real Xm caracterizat de faptul că probabilitatea (p) ca valorile distribuției (X) să fie inferioare acestui număr (Xm) este mai mică sau egală cu 0,5 și că, simultan, probabilitatea (p) ca valorile distribuției (X) să fie inferioare sau egale cu Xm este mai mare sau egală cu 0,5. O definiție mai practică consideră mediana ca fiind a 50-a percentilă a unei distribuții de numere ordonate în ordine crescătoare. În termeni mai simpli, mediana este punctul de mijloc al unui ansamblu ordonat de numere impare, sau media a două puncte de mijloc ale unui ansamblu ordonat de numere pare.

Deviația standard robustă

Pentru a se obține o estimare fiabilă a variabilității în jurul mediei, este necesar să se țină cont de deviația standard robustă, astfel cum a fost estimată conform Stuart și Kendall (4). Formula oferă deviația standard asimptotică robustă, adică estimarea robustă a variabilității datelor luate în considerare, în care N este numărul de observații și IQR este intervalul interquartil, care înglobează exact 50% din cazurile unei anumite distribuții de probabilitate:

Calculul intervalului interquartil se efectuează calculând magnitudinea diferenței dintre a 75-a și a 25-a percentilă.

unde percentila este valoarea Xpc caracterizată de faptul că probabilitatea (p) ca valorile distribuției să fie inferioare Xpc este mai mică sau egală cu o sutime specifică și că, simultan, probabilitatea (p) ca valorile distribuției să fie mai mici sau egale cu Xpc este mai mare sau egală cu acea sutime specifică. Sutimea indică cuantila de distribuție reținută. În cazul medianei, aceasta este egală cu 50/100.

În scopuri practice, percentila este valoarea de distribuție care corespunde unei arii specifice trasate dintr-o curbă de distribuție sau de densitate. De exemplu, a 25-a percentilă reprezintă valoarea de distribuție care corespunde unei arii egale cu 0,25 sau 25/100.

În prezenta metodă, percentilele sunt calculate pe baza valorilor reale care apar în datele din matrice (procedura de calculare a percentilelor).

Coeficientul de variație robust (%)

CVr% reprezintă un număr pur care indică procentajul de variabilitate al seriei de numere analizate. Din acest motiv, coeficientul este foarte util pentru verificarea fiabilității evaluatorilor comisiei.

Intervalele de încredere pentru mediană la 95 %

Intervalele de încredere la 95 % (valoarea erorii de tip I egale cu 0,05 sau 5 %) reprezintă intervalul în care valoarea medianei ar putea varia în ipoteza în care ar fi posibilă repetarea experienței de un număr infinit de ori. În practică, acesta indică intervalul de variabilitate al testului în condițiile de operare reținute, dacă se pleacă de la ipoteza că s-ar putea repeta de mai multe ori. Intervalul ajută la evaluarea fiabilității testului, ca și în cazul CVr%.

unde C = 1,96 pentru intervalul de încredere la nivelul de 95 %.

Un exemplu al fișei de calcul este prezentat în anexa I la standardul IOC/T 20/Doc. nr. 15.

Bibliografie

Wilkinson, L. 1990. Systat: The system for statistics. Evanston, IL.SYSTAT Inc.

Cicchitelli, G. 1984. Probabilità e Statistica. Maggioli Editore, Rimini.

Massart, D.L.; Vandeginste, B.G.M.; Deming, Y.; Michotte, L. 1988. Chemometrics. A textbook. Elsevier. Amsterdam.

Kendall, M.G.; Stuart, A. 1967. The advanced theory of statistics. Vol. 1. Hafner Publishing Co.

McGill, R.; Tukey, J.W.; Larsen, W.A. 1978. Variation of Box Plots. The American Statistician, 32, (2), 12-16.

IOC/T.28/Doc. nr. 1 septembrie 2007, Orientări pentru acreditarea laboratoarelor de teste senzoriale cu referire specială la uleiul de măsline virgin în conformitate cu standardul ISO/IEC 17025:2005.

IOC/T.20/Doc. nr. 14.

IOC/T.20/Doc. nr. 15.

ISO/IEC 17025:05.

Stătut/de drojdie: aromă caracteristică uleiului extras din măsline strânse sau depozitate în condiții de natură să determine un stadiu avansat de fermentare anaerobă sau uleiului rămas în contact cu depunerile rezultate în urma decantării, care au suferit, de asemenea, un proces de fermentare anaerobă în containere și cuve.

Mucegăit/umed/de pământ: Aromă caracteristică uleiului de măsline obținut din fructe atacate de mucegaiuri și de drojdii, ca rezultat al depozitării acestora timp de mai multe zile în condiții de umiditate sau uleiului obținut din măsline care au fost culese cu pământ sau acoperite cu noroi și care nu au fost spălate.

De vin/oțetit/acid/acru: aromă caracteristică a anumitor uleiuri care amintește de vin sau de oțet. Această aromă se datorează în principal unui proces de fermentare aerobă a măslinelor sau a resturilor de pastă de măsline de pe rogojini care nu au fost probabil spălate corespunzător, ceea ce a condus la formarea de acid acetic, de acetat de etil și de etanol.

Rânced: aromă a uleiurilor care au fost supuse unui proces intens de oxidare.

Măsline înghețate (lemn umed): aromă caracteristică uleiurilor extrase din măsline care au suferit de pe urma înghețului în copaci.

robust, atunci când mediana atributului este mai mare decât 6,0;

mediu, atunci când mediana atributului este mai mare decât 3,0 și mai mică sau egală cu 6,0;

delicat, atunci când mediana atributului este mai mică sau egală cu 3,0.

pahare (standardizate) care conțin probele, identificate cu un număr de cod, acoperite cu o sticlă de ceas și păstrate la 28 °C ± 2 °C;

foaia de profil (a se vedea figura 1), pe suport de hârtie sau în format electronic, care îndeplinește condițiile privind foaia de profil, împreună cu instrucțiunile pentru utilizarea sa în cazul în care este necesar;

pix sau cerneală indelebilă;

tăvi cu felii de mere și/sau apă, apă gazoasă și/sau pesmeți;

un pahar cu apă la temperatura ambiantă;

o foaie care reamintește normele generale enumerate la punctele 8.4 și 9.1.1;

scuipători.

Să se abțină de la fumat și să nu bea cafea cu cel puțin 30 minute înainte de ora stabilită pentru test.

Trebuie să nu folosească parfumuri, produse cosmetice sau un săpunuri al căror miros ar putea să persiste în momentul testului. Trebuie să-și spele mâinile cu un săpun fără miros, apoi să le clătească și să le usuce ori de câte ori este necesar pentru a elimina orice miros.

Să nu mănânce nimic cu cel puțin o oră înaintea degustării.

În cazul unui disconfort fizic, în special dacă le este afectat simțul mirosului sau al gustului sau dacă se află sub efectul unui impact psihologic care îi poate împiedica să se concentreze, degustătorii îl informează pe președintele comisiei pentru ca acesta să îi retragă din testare.

După îndeplinirea celor menționate, degustătorii își ocupă locul în cabina care le-a fost atribuită, într-un mod ordonat și silențios.

Ei trebuie să citească atent instrucțiunile care figurează pe foaia de profil și să înceapă examinarea probei numai după ce sunt pe deplin pregătiți pentru sarcina de îndeplinit (în mod relaxat și lipsit de grabă). În cazul unor nelămuriri, trebuie să se consulte în particular cu președintele comisiei.

Atunci când își îndeplinesc sarcinile, degustătorii păstrează tăcerea.

Telefoanele lor mobile trebuie să fie oprite pe toată durata degustării, pentru a nu afecta concentrația și activitatea colegilor.

În cazul uleiului de măsline extravirgin, mediana defectelor este egală cu 0,0, iar mediana atributului fructat este mai mare de 0,0.

În cazul uleiului de măsline virgin, mediana defectelor este mai mare de 0,0 și mai mică sau egală cu 3,5, iar mediana atributului fructat este mai mare de 0,0.

În cazul uleiului de măsline virgin lampant, mediana defectelor depășește 3,5 sau mediana defectelor este mai mică sau egală cu 3,5, iar mediana atributului fructat este egală cu 0,0.

Apendice

Apendice

Metoda de calcul al medianei și al intervalelor de încredere

Mediana

Mediana se definește ca numărul real Xm caracterizat de faptul că probabilitatea (p) ca valorile distribuției (X) să fie inferioare acestui număr (Xm) este mai mică sau egală cu 0,5 și că, simultan, probabilitatea (p) ca valorile distribuției (X) să fie inferioare sau egale cu Xm este mai mare sau egală cu 0,5. O definiție mai practică consideră mediana ca fiind a 50-a percentilă a unei distribuții de numere ordonate în ordine crescătoare. În termeni mai simpli, mediana este punctul de mijloc al unui ansamblu ordonat de numere impare, sau media a două puncte de mijloc ale unui ansamblu ordonat de numere pare.

Deviația standard robustă

Pentru a se obține o estimare fiabilă a variabilității în jurul mediei, este necesar să se țină cont de deviația standard robustă, astfel cum a fost estimată conform Stuart și Kendall (4). Formula oferă deviația standard asimptotică robustă, adică estimarea robustă a variabilității datelor luate în considerare, în care N este numărul de observații și IQR este intervalul interquartil, care înglobează exact 50% din cazurile unei anumite distribuții de probabilitate:

Calculul intervalului interquartil se efectuează calculând magnitudinea diferenței dintre a 75-a și a 25-a percentilă.

unde percentila este valoarea Xpc caracterizată de faptul că probabilitatea (p) ca valorile distribuției să fie inferioare Xpc este mai mică sau egală cu o sutime specifică și că, simultan, probabilitatea (p) ca valorile distribuției să fie mai mici sau egale cu Xpc este mai mare sau egală cu acea sutime specifică. Sutimea indică cuantila de distribuție reținută. În cazul medianei, aceasta este egală cu 50/100.

În scopuri practice, percentila este valoarea de distribuție care corespunde unei arii specifice trasate dintr-o curbă de distribuție sau de densitate. De exemplu, a 25-a percentilă reprezintă valoarea de distribuție care corespunde unei arii egale cu 0,25 sau 25/100.

În prezenta metodă, percentilele sunt calculate pe baza valorilor reale care apar în datele din matrice (procedura de calculare a percentilelor).

Coeficientul de variație robust (%)

CVr% reprezintă un număr pur care indică procentajul de variabilitate al seriei de numere analizate. Din acest motiv, coeficientul este foarte util pentru verificarea fiabilității evaluatorilor comisiei.

Intervalele de încredere pentru mediană la 95 %

Intervalele de încredere la 95 % (valoarea erorii de tip I egale cu 0,05 sau 5 %) reprezintă intervalul în care valoarea medianei ar putea varia în ipoteza în care ar fi posibilă repetarea experienței de un număr infinit de ori. În practică, acesta indică intervalul de variabilitate al testului în condițiile de operare reținute, dacă se pleacă de la ipoteza că s-ar putea repeta de mai multe ori. Intervalul ajută la evaluarea fiabilității testului, ca și în cazul CVr%.

unde C = 1,96 pentru intervalul de încredere la nivelul de 95 %.

Un exemplu al fișei de calcul este prezentat în anexa I la standardul IOC/T 20/Doc. nr. 15.

Bibliografie

Wilkinson, L. 1990. Systat: The system for statistics. Evanston, IL.SYSTAT Inc.

Cicchitelli, G. 1984. Probabilità e Statistica. Maggioli Editore, Rimini.

Massart, D.L.; Vandeginste, B.G.M.; Deming, Y.; Michotte, L. 1988. Chemometrics. A textbook. Elsevier. Amsterdam.

Kendall, M.G.; Stuart, A. 1967. The advanced theory of statistics. Vol. 1. Hafner Publishing Co.

McGill, R.; Tukey, J.W.; Larsen, W.A. 1978. Variation of Box Plots. The American Statistician, 32, (2), 12-16.

IOC/T.28/Doc. nr. 1 septembrie 2007, Orientări pentru acreditarea laboratoarelor de teste senzoriale cu referire specială la uleiul de măsline virgin în conformitate cu standardul ISO/IEC 17025:2005.

IOC/T.20/Doc. nr. 14.

IOC/T.20/Doc. nr. 15.

ISO/IEC 17025:05.

ANEXA XIIIDOVADA RAFINĂRII

ANEXA XIII

DOVADA RAFINĂRII

NEUTRALIZAREA ȘI DECOLORAREA ULEIULUI DE MĂSLINE ÎN LABORATOR

Neutralizarea uleiului

Aparatură

pahar de laborator de 300 ml de formă înaltă;

centrifugă de laborator cu tuburi de 100 mm;

pahar de laborator de 250 ml;

baloane de 100 ml;

pâlnie de decantare de 1 litru.

Reactivi

soluție apoasă de hidroxid de sodiu de 12 %;

soluție etanolică de 1 % de fenolftaleină;

hexan pur pentru analiză;

alcool izopropilic pur pentru analiză.

Mod de lucru

Uleiuri cu o aciditate exprimată în acid oleic mai mică de 30 %

Se introduc, într-un pahar de laborator de 300 mm de formă înaltă, 50 g de ulei brut și se încălzesc până la 65 °C la baie de aburi. Agitându-se lent, se adaugă o cantitate de soluție de hidroxid de sodiu de 12 % ce corespunde acidității libere a uleiului, cu un exces de 5 %. Se continuă să se agite timp de cinci minute, menținând temperatura la 65 °C.

Se transferă totul în eprubete de centrifugare de 100 ml, se separă pasta de săpun prin centrifugare. Se toarnă uleiul decantat într-un pahar de laborator de 250 ml și se spală cu 50–60 ml apă distilată fiartă, eliminând în același timp stratul apos cu ajutorul unui sifon. Se repetă spălările până la eliminarea completă a urmelor de săpun rezidual (dispariția colorației roz a fenolftanelinei).

Se centrifughează uleiul pentru a elimina micile cantități de apă reziduală.

Uleiuri cu o aciditate exprimată în acid oleic mai mare de 30 %

Într-o pâlnie de decantare de un litru, se introduc 50 g de ulei brut, 200 ml de hexan, 100 ml de alcool izopropilic și o cantitate de soluție de hidroxid de sodiu de 12 % ce corespunde acidității libere a uleiului, cu un supliment de 0,3 %.

Se agită energic timp de 1 minut. Se adaugă 100 ml de apă distilată, se agită din nou și se lasă în repaus.

După separarea straturilor, se lasă să se scurgă stratul inferior ce conține săpun. Între cele două straturi (uleios deasupra și apos dedesubt) se formează deseori un strat intermediar format din mucilagii și din substanțe insolubile care trebuie să fie, de asemenea, eliminat. În continuare, se trece la spălarea soluției hexanice de ulei neutru cu 50–60 ml dintr-o soluție de alcool izopropilic/apă distilată 1/1 (v/v) până la dispariția colorației roz a fenolftaleinei. Se trece apoi la eliminarea completă a hexanului prin distilare în vid (de exemplu, în evaporatorul rotativ).

Decolorarea uleiului neutralizat

Aparatură

balon de 250 ml cu 3 gâturi din sticlă rodată ce permit inserarea:

unui termometru gradat în grade ce permite citirea până la 90 °C;

un agitator mecanic care funcționează cu 250–300 turații pe minut, echipat pentru funcționarea în vid;

un racord pentru pompa de vid;

pompă de vid, echipată cu un manometru, capabil să dea presiuni reziduale de 15–30 milibari.

Mod de lucru

Se cântăresc în balonul cu 3 gâturi aproximativ 100 g de ulei neutralizat. Se inserează termometrul și agitatorul, se conectează la pompa de vid și se încălzește până la 90 °C, agitând. Se menține această temperatură, agitând mereu, până când uleiul analizat elimină complet umiditatea sa (aproximativ treizeci de minute). Se întrerupe vidul și se adaugă 2–3 g de pământ activat.

Se restabilește vidul până la obținerea unei presiuni reziduale de 15–30 milibari și, la aceeași temperatură de 90 °C, se agită timp de treizeci de minute la aproximativ 250 turații pe minut.

Se filtrează apoi la cald într-o etuvă termostatică (50–60 °C).

pahar de laborator de 300 ml de formă înaltă;

centrifugă de laborator cu tuburi de 100 mm;

pahar de laborator de 250 ml;

baloane de 100 ml;

pâlnie de decantare de 1 litru.

soluție apoasă de hidroxid de sodiu de 12 %;

soluție etanolică de 1 % de fenolftaleină;

hexan pur pentru analiză;

alcool izopropilic pur pentru analiză.

balon de 250 ml cu 3 gâturi din sticlă rodată ce permit inserarea:

unui termometru gradat în grade ce permite citirea până la 90 °C;

un agitator mecanic care funcționează cu 250–300 turații pe minut, echipat pentru funcționarea în vid;

un racord pentru pompa de vid;

pompă de vid, echipată cu un manometru, capabil să dea presiuni reziduale de 15–30 milibari.

unui termometru gradat în grade ce permite citirea până la 90 °C;

un agitator mecanic care funcționează cu 250–300 turații pe minut, echipat pentru funcționarea în vid;

un racord pentru pompa de vid;

ANEXA XIVNOTELE ADIȚIONALE 2, 3 ȘI 4 LA CAPITOLUL 15 DIN NOMENCLATURA COMBINATĂ

ANEXA XIV

NOTELE ADIȚIONALE 2, 3 ȘI 4 LA CAPITOLUL 15 DIN NOMENCLATURA COMBINATĂ

Nota 2 A: Se consideră ulei de măsline în sensul numerelor de cod NC 1509 și 1510 numai uleiul ce provine exclusiv din tratarea măslinelor, cu excepția uleiului de măsline reesterificat și a oricărui amestec de ulei de măsline cu uleiuri de altă natură.

Prezența uleiului de măsline reesterificat sau a uleiurilor de altă natură se stabilește cu ajutorul metodelor indicate în anexele VII, IX și XII. Caracteristicile analitice referitoare la conținutul de steroli și de acizi al tuturor uleiurilor de măsline de la numerele de cod NC 1509 și 1510 figurează în tabelul menționat în continuare.

Nota 2 B: Sunt considerate uleiuri de măsline virgine uleiurile obținute din măsline numai prin procedee mecanice sau prin alte procedee fizice, în condiții, în special termice, care nu alterează uleiul, care nu au fost supuse altui tratament decât spălarea, decantarea, centrifugarea și filtrarea, cu excepția uleiurilor obținute din măsline cu ajutorul solvenților (1510) și definite la punctele I și II de mai jos.

Se consideră ulei de măsline virgin lampant, în sensul subpoziției 15091010, uleiul care prezintă, indiferent de aciditatea lui:

un conținut de alcooli alifatici mai mic sau egal cu 400 mg pe kilogram;

un conținut de eritrodiol și uvaol mai mic sau egal cu 4,5 %,

un conținut de acizi grași saturați în poziția 2 a trigliceridelor mai mic sau egal cu 1,3 %;

și/sau una dintre caracteristicile următoare:

un număr de peroxid mai mare de 20 miliechivalenți de 02 pe kilogram;

un conținut de solvenți halogenați volatili totali mai mare de 0,2 mg pe kilogram și în orice caz mai mare de 0,1 mg pe kilogram pentru fiecare dintre ei;

un coeficient de extincție K270 mai mare de 0,25, și, după tratarea uleiului pe alumină activată, mai mic de 0,11. Uleiurile cu un conținut de acizi grași liberi, exprimat în acid oleic, mai mare de 3,3 g pe 100 g pot avea, după trecerea pe alumină activată, în conformitate cu metoda indicată în anexa XV, un coeficient de extincție K270 mai mare de 0,11. În acest caz, după neutralizarea și decolorarea efectuate în laborator, ele trebuie să aibă următoarele caracteristici:

un coeficient de extincție K270 mai mic sau egal cu 1,20;

adică:

ΔΚ = Km – 0,5 (Km - 4 + Km + 4)

Km desemnează coeficientul de extincție la lungimea de undă din punctul maxim al curbei de absorbție în apropiere de 270 nm,

Km – 4 și Km + 4 desemnează coeficienți de extincție la lungimi de undă mai mici și mai mari de 4 nm decât aceea în Km;

caracteristici organoleptice ce determină apariția defectelor perceptibile cu o intensitate mai mare decât limita de acceptabilitate, cu un rezultat de analiză senzorială mai mic de 3,5.

Se consideră ulei de măsline virgin, în sensul codului NC 15091090, uleiul de măsline care prezintă următoarele caracteristici:

o aciditate, exprimată în acid oleic, mai mică sau egală cu 3,3 g pe 100 grame;

un număr de peroxid mai mic sau egal cu 20 miliechivalenți 02 pe kilogram;

un conținut de alcooli alifatici mai mic sau egal cu 300 mg pe kilogram;

un conținut de solvenți halogenați volatili totali mai mic sau egal cu 0,2 mg pe kilogram și în orice caz mai mic sau egal cu 0,1 mg pe kilogram pentru fiecare dintre ei;

În cazul în care K270 este mai mare de 0,25, trebuie să se realizeze o altă determinare după trecerea pe alumină; K270 nu trebuie să fie mai mare de 0,10.

o variație a coeficientului de extincție (ΔΚ) de aproximativ 270 nm mai mică sau egală cu 0,010;

caracteristici organoleptice ce determină apariția chiar a defectelor perceptibile cu o intensitate mai mică decât limita de acceptabilitate, cu un rezultat de analiză senzorială mai mare de 3,5;

un conținut de eritrodiol + uvaol mai mic de 4,5 %;

un conținut de acizi grași saturați în poziția 2 a trigliceridelor mai mic sau egal cu 1,3 %.

Nota 2 C: Se consideră ca încadrat la codul NC 15099000 uleiul de măsline obținut prin tratarea uleiurilor încadrate la codurile NC 15091010 și/sau 15091090, chiar îndoit cu ulei de măsline virgin, care prezintă caracteristicile următoare:

o aciditate, exprimată în acid oleic, mai mică sau egală cu 3,3 g pe 100 de grame;

un conținut de alcooli alifatici mai mic sau egal cu 350 mg pe kilogram;

un coeficient de extincție K270 mai mare de 0,25 și mai mic sau egal cu 1,20 și, după trecerea mostrei pe alumină activată, mai mare de 0,10;

o variație a coeficientului de extincție (ΔΚ) de aproximativ 270 nm mai mare de 0, 01și mai mică sau egală cu 0,16;

un conținut de eritrodiol și uvaol mai mic sau egal cu 4,5 %;

un conținut de acizi grași saturați în poziția 2 mai mic sau egal cu 1,5 %.

Nota 2 D: Se consideră uleiuri brute încadrate la codul NC 15100010 uleiurile, în special uleiurile din resturi de măsline, care prezintă caracteristicile următoare:

o aciditate, exprimată în acid oleic, mai mare de 2 g pe 100 de grame;

un conținut de eritrodiol și uvaol mai mare de 12 %;

un conținut de acizi grași saturați în poziția 2 a trigliceridelor mai mic sau egal cu 1,8 %.

Nota 2 E: Se consideră uleiuri încadrate la codul NC 15100090 uleiurile obținute prin tratarea uleiurilor încadrate la codul NC 15100010, chiar îndoite cu ulei de măsline virgin, care nu prezintă caracteristicile menționate în punctele I și II, cu condiția ca ele să prezinte un conținut de acizi grași saturați în poziția 2 a trigliceridelor mai mic sau egal cu 2 %.

Nota 3: Sunt excluse de la codurile NC 15220031 și 15220039:

reziduurile provenite din tratarea substanțelor grase ce conțin ulei cu un indice de iod, determinat conform metodei indicate în anexa XVI, mai mic de 70 sau mai mare de 100;

reziduurile provenite din tratarea substanțelor grase ce conțin ulei cu un indice de iod între 70 și 100, dar a cărui suprafață a valorii de vârf cu un volum de retenție a beta-sitosterolului, determinată conform dispozițiilor din anexa V la regulamentul în cauză la nota complementară 4 menționată în continuare, reprezintă mai puțin de 93 % din suprafața totală a valorilor de vârf ale sterolilor.