A doua directivă a Comisiei din 14 mai 1982 privind apropierea legislației statelor membre cu privire la metodele de analiză necesare pentru verificarea compoziției produselor cosmetice (82/434/CEE)

având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Economice Europene,

având în vedere Directiva 76/768/CEE a Consiliului din 27 iulie 1976 privind apropierea legislației statelor membre cu privire la produsele cosmetice, modificată de Directiva 79/661/CEE, în special articolul 8 alineatul (1),

întrucât Directiva 76/768/CEE prevede testarea oficială a produselor cosmetice cu scopul constatării îndeplinirii condițiilor prescrise în dispozițiile Comunității privind compoziția produselor cosmetice;

întrucât toate metodele de analiză necesare trebuie să fie stabilite cât mai repede posibil; întrucât prima etapă în atingerea acestui obiectiv a fost deja parcursă prin definirea anumitor metode în Directiva 80/1335/CEE a Comisiei, a doua etapă constă în definirea metodelor de identificare a unor agenți de oxidare și de determinare a apei oxigenate în produsele cosmetice pentru îngrijirea părului, de identificare și determinare semicantitativă a anumitor coloranți de oxidare în vopselele de păr, de identificare și determinare a azotitului, de identificare și determinare a formaldehidei libere, de determinare a rezorcinolului în șampon și loțiuni de păr, de determinare a metanolului față de etanol sau 2-propanol;

întrucât măsurile stabilite de prezenta directivă sunt în conformitate cu avizul Comitetului privind adaptarea Directivei 76/768/CEE la progresul tehnic,

Statele membre adoptă toate măsurile necesare pentru a asigura ca în timpul testării oficiale a produselor cosmetice:să fie efectuate în conformitate cu metodele descrise în anexă.

identificarea agenților de oxidare și determinarea perhidrolului în produsele de îngrijire a părului,

identificarea și determinarea semicantitativă a anumitor coloranți de oxidare în vopselele de păr,

identificarea și determinarea azotitului,

identificarea și determinarea formaldehidei libere,

determinarea rezorcinolului în șampoane și loțiuni de păr,

determinarea metanolului față de etanol sau 2-propanol

Statele membre pun în aplicare actele cu putere de lege și actele administrative necesare pentru a se conforma prezentei directive până la 31 decembrie 1983.

Statele membre informează de îndată Comisia cu privire la aceasta.

Prezenta directivă se adresează statelor membre.

ANEXĂ

ANEXĂ

IDENTIFICAREA AGENȚILOR OXIDANȚI ȘI DETERMINAREAAPEI OXIGENATE ÎN PRODUSELE PENTRU ÎNGRIJIREA PĂRULUI

OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Determinarea iodometrică a apei oxigenate în produsele cosmetice este posibilă numai în absența altor agenți de oxidare care formează iod din ioduri. Prin urmare, înainte de determinarea iodometrică a apei oxigenate, sunt necesare detectarea și identificarea tuturor celorlalți agenți de oxidare prezenți. Această identificare se face în două etape; prima etapă se referă la persulfați, bromați și apă oxigenată, iar cea de-a doua la peroxidul de bariu.

IDENTIFICAREA PERSULFAȚILOR, BROMAȚILOR ȘI APEI OXIGENATE

PRINCIPIU

Persulfatul de sodiu, persulfatul de potasiu și persulfatul de amoniu; bromatul de potasiu, bromatul de sodiu și apa oxigenată – provenită sau nu din peroxidul de bariu – sunt identificate cu ajutorul cromatografiei pe hârtie, folosindu-se doi solvenți de developare.

REACTIVI

Toți reactivii trebuie să fie de puritate analitică.

Soluții apoase de referință 0,5 % (m/v) ale următorilor compuși:

Persulfat de sodiu

Persulfat de potasiu

Persulfat de amoniu

Bromat de potasiu

Bromat de sodiu

Apă oxigenată

Solvent de developare A, 80 % (v/v) etanol

Solvent de developare B, benzen – metanol – 3-metil-1-butanol – apă (raport volumetric 34:38:18:10)

Agent de detectare A, soluție apoasă de iodură de potasiu 10 % (m/v)

Agent de detectare B, soluție apoasă de amidon 1 % (m/v)

Agent de detectare C, acid clorhidric 10 % (m/m)

Acid clorhidric 4 n

APARATURĂ ȘI ECHIPAMENT

Hârtie cromatografică (hârtie Whatman nr. 3 și nr. 4 sau echivalentă)

Micropipete de 1 μl

Baloane cotate de 100 ml

Filtre cutate

Aparatură pentru cromatografie descendentă pe hârtie

PREGĂTIREA PROBEI

Produși solubili în apă

Se prepară două soluții din fiecare probă prin dizolvarea a 1 g și respectiv 5 g de produs în 100 ml apă. Se folosește 1 μl din fiecare dintre aceste soluții pentru realizarea cromatografiei pe hârtie descrise în secțiunea 5.

Produși greu solubili în apă

Se cântăresc 1 g și, respectiv, 5 g de probă și se dispersează în 50 ml apă, se aduce la semn cu apă, în fiecare din cele două cazuri, și se amestecă. Se filtrează cele două dispersii prin filtrul cutat (3.4) și se folosește 1 μl din fiecare filtrat pentru realizarea cromatografiei pe hârtie descrise în secțiunea 5.

Se prepară încă o dată două dispersii din fiecare probă prin dispersarea a 1 g și respectiv 5 g în 50 ml apă, acidificată cu acid clorhidric diluat (2.7), se aduce la semn cu apă și se amestecă. Se filtrează dispersiile peste filtrul cutat (3.4) și se folosește 1 μl din fiecare filtrat pentru realizarea cromatografiei pe hârtie descrise în secțiunea 5.

Creme

Se dispersează 5 g și 20 g din fiecare produs în 100 ml apă și se folosesc dispersiile pentru realizarea cromatografiei pe hârtie descrise în secțiunea 5.

METODĂ

În două tancuri cromatografice separate se pun cantități adecvate de solvent A (2.2) și B (2.3), cu scopul realizării cromatografiei descendente pe hârtie. Se saturează tancurile cromatografice cu vapori de solvent pentru cel puțin 24 ore.

Se pune câte 1 μl din soluția probă și din soluția de referință preparată conform secțiunilor 4 și 2.1 pe câte un punct de pornire de pe banda de hârtie cromatografică (Whatman nr. 3 sau echivalentă) de lungime 40 cm și lățime 20 cm (3.1) sau alt format adecvat și se evaporă soluția în aer.

Se pune banda cromatografică (5.2) în tancul cromatografic umplut cu soluție de developare A (5.1) și se developează până când frontul de solvent avansează 35 cm (aproximativ 15 ore).

Se repetă procedeul descris în secțiunile 5.2 și 5.3, utilizând hârtie cromatografică (Whatman nr. 4 sau echivalentă) (3.1) și solvent de developare B. Se cromatografiază până când frontul solventului avansează 35 cm (aproximativ 5 ore).

După developare se îndepărtează cromatogramele și se usucă la aer.

Se pun în evidență petele din cromatogramă prin pulverizare succesivă cu:

agent de detectare A (2.4), urmat la scurt timp de agentul de detectare B (2.5). Petele de persulfați apar primele în cromatogramă și sunt urmate de petele de apă oxigenată. Se marchează petele cu un creion;

agent de detectare C (2.6) pe cromatogramele obținute conform secțiunii 5.6.1; prezența bromaților este indicată prin pete albastru-cenușiu pe cromatogramă.

În condițiile menționate mai sus, corespunzătoare solvenților de developare A (2.2) și B (2.3), valorile Rf ale substanțelor de referință (2.1) sunt aproximativ următoarele:

IDENTIFICAREA PEROXIDULUI DE BARIU

PRINCIPIU

Peroxidul de bariu se identifică prin formarea apei oxigenate după acidificarea probei (A.4.2) și prin prezența ionului de bariu:

în absența persulfaților (A), prin adăugarea de acid sulfuric diluat la o porțiune acidificată din soluția probă (B.4.1), în urma căreia se formează un precipitat alb de sulfat de bariu. Prezența ionilor de bariu în probă (B.4.1) este încă o dată confirmată prin cromatografie pe hârtie în modul descris mai sus (B.5);

când peroxidul de bariu și persulfații sunt prezenți simultan (B.4.2), prin asimilarea reziduului din soluție (B.4.2) într-o bază; după dizolvarea în acid clorhidric, prezența ionilor de bariu este confirmată în soluția topiturii (B.4.2.3) prin cromatografie pe hârtie și prin precipitarea sulfatului de bariu.

REACTIVI

Metanol

Acid clorhidric concentrat 36 %(m/m)

Acid clorhidric 6 n

Acid sulfuric 4 n

Sare disodică a acidului rodizonic

Clorură de bariu (BaCl2•2H2O)

Carbonat de sodiu anhidru

Clorură de bariu, soluție apoasă 1 % (m/v)

Solvent de developare constând în metanol, acid clorhidric concentrat (36 %) și apă (raport volumetric 80:10:10).

Agent de detectare, soluție apoasă 0,1 % (m/v) de sare disodică a acidului rodizonic, proaspăt preparată chiar înainte de folosire.

APARATURĂ ȘI ECHIPAMENT

Micropipete de 5 μl

Creuzete de platină

Balon cotat de 100 ml

Hârtie cromatografică Schleicher și Schull 2043 b sau echivalentă. Se curăță hârtia prin developare peste noapte într-un tanc cromatografic descendent (A.3.5), conținând solvent de developare (B.2.9), și apoi se usucă.

Hârtie de filtru cutată

Aparatura uzuală pentru realizarea cromatografiei descendente pe hârtie.

PREGĂTIREA PROBEI

Produse care nu conțin persulfați

Se dispersează 2 g de produs în 50 ml apă și se aduce pH-ul dispersiei la aproximativ 1 cu acid clorhidric (B.2.3).

Se transferă dispersia cu apă într-un balon cotat de 100 ml, se aduce la semn cu apă și se amestecă. Se folosește această dispersie pentru analiza prin cromatografie pe hârtie descrisă în secțiunea 5 și pentru identificarea bariului prin precipitarea sulfatului.

Produse care conțin persulfați

Se dispersează 2 g de produs în 100 ml de apă și se filtrează.

Se adaugă la reziduul uscat carbonat de sodiu (B.2.7) de 7 până la 10 ori greutatea sa, se amestecă și se topește amestecul într-un creuzet de platină (B.3.2) pentru o jumătate de oră.

Se răcește la temperatura camerei, se dizolvă topitura în 50 ml apă și se filtrează (B.3.5).

Se dizolvă reziduul din topitură în acid clorhidric (B.2.3) și se aduce la 100 ml cu apă. Se folosește această soluție pentru analiza cromatografiei pe hârtie descrise în secțiunea 5 și pentru identificarea bariului prin precipitare din sulfat.

METODĂ

Se pune o cantitate adecvată de solvent de developare (B.2.9) într-un tanc pentru cromatografie ascendentă pe hârtie și se saturează tancul pentru cel puțin 15 ore.

Pe o bucată de hârtie cromatografică – tratată în prealabil conform secțiunii B.3.4 – se aplică 5 μl din fiecare dintre soluțiile preparate conform secțiunilor B.4.1.2 și B.4.2.4 și soluție de referință B.2.8 în trei puncte de pornire.

Se usucă la aer petele de probă și de referință. Se developează cromatograma până când frontul solventului urcă 30 cm.

Se îndepărtează cromatograma din vas și se usucă la aer.

Se pun în evidență petele de pe cromatogramă prin pulverizarea pe hârtie a agentului de detectare B.2.10. În prezența bariului, pe cromatogramă apar pete roșii cu o valoare a Rf de aproximativ 0,10.

DETERMINAREA APEI OXIGENATE

PRINCIPIU

Determinarea iodometrică a apei oxigenate se bazează pe următoarea reacție:

Această conversie are loc încet, dar poate fi accelerată prin adăugare de molibdat de amoniu. Iodul format se determină prin titrare cu tiosulfat de sodiu și este o măsură a conținutului de apă oxigenată.

DEFINIȚIE

Conținutul de apă oxigenată măsurat în modul descris mai sus se exprimă ca procent masic de produs (% m/m).

REACTIVI

Toți reactivii trebuie să fie de puritate analitică.

Acid sulfuric 2 n

Iodură de potasiu

Molibdat de amoniu

Tiosulfat de sodiu 0,1 n

Soluție de iodură de potasiu 10 % (m/v), proaspăt preparată chiar înainte de folosire

Soluție de molibdat de amoniu 20 % (m/v)

Soluție de amidon 1 % (m/v)

APARATURĂ ȘI ECHIPAMENT

Pahare de 100ml

Biurete de 50ml

Baloane cotate de 250ml

Cilindri gradați de 25 și 100 ml

Pipete de 10 ml cu un singur marcaj

Flacoane conice de 250ml

METODĂ

Într-un pahar de 100 ml se cântăresc 10 g (m grame) de produs, conținând aproximativ 0,6 g apă oxigenată. Se transferă conținutul cu apă într-un balon cotat de 250 ml, se aduce cu apă la semn și se amestecă.

Într-un pahar conic de 250 ml (4.6) se pun cu pipeta 10 ml de soluție de probă (5.1) și se adaugă succesiv 100 ml acid sulfuric 2 n (3.1), 20 ml soluție de iodură de potasiu (3.5) și trei picături de soluție de molibdat de amoniu (3.6).

Iodul format se titrează imediat cu soluție de tiosulfat de sodiu 0,1 n (3.4) și exact înainte de virare se adaugă câțiva mililitri de soluție de amidon ca indicator (3.7). Se înregistrează consumul de tiosulfat de sodiu 0,1 n (3.4), în mililitrii (V).

În modul descris mai sus în secțiunile 5.2 și 5.3, se realizează o determinare oarbă, înlocuind 10 ml din soluția probă cu 10 ml apă. Se înregistrează consumul de soluție de tiosulfat de sodiu 0,1 n în determinarea oarbă (Vo ml).

CALCUL

Se calculează conținutul de apă oxigenată din produs ca procent masic (% m/m) cu ajutorul formulei de mai jos:

în care:

mcantitatea în grame de produs analizat (5.1),Voconsumul în mililitri de soluție de tiosulfat 0,1 n pentru determinarea oarbă (5.4),Vconsumul în mililitri de soluție de tiosulfat 0,1 n în titrarea soluției de probă (5.3).

Vezi standardul ISO 5725.

Pentru un produs conținând aproximativ 6 % m/m apă oxigenată, diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în paralel pe aceeași probă nu trebuie să depășească o valoare absolută de 0,2 %.

IDENTIFICAREA ȘI DETERMINAREA SEMICANTITATIVĂ A ANUMITOR COLORANȚI DE OXIDARE ÎN VOPSELELE PENTRU PĂR

OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta metodă este adecvată pentru identificarea și determinarea semicantitativă a următoarelor substanțe în vopselele pentru păr, sub formă de cremă sau lichide:

PRINCIPIU

Coloranții de oxidare sunt extrași la pH 10 cu etanol 96 % din vopselele în formă de cremă sau lichid și identificați prin cromatografie în strat subțire, uni- sau bi-dimensională.

Pentru determinarea semicantitativă a acestor substanțe, cromatograma probelor este comparată folosind patru sisteme de developare cu substanțele de referință produse în același timp și în condiții pe cât posibil similare.

REACTIVI

Toți reactivi trebuie să fie de puritate analitică.

Etanol anhidru

Acetonă

Etanol, 96 % v/v

Soluție amoniacală, 25 % (d_4_(20) = 0·91)

Acid ascorbic L(+)

Cloroform

Ciclohexan

Azot tehnic

Toluen

Benzen

n-butanol

2-butanol

Acid hipofosforos, soluție 50 % v/v

Reactiv diazo. Unul din următoarele:

clorbenzensulfonat de 3-nitro-1-benzendiazoniu (forma de sare stabilă) ca în Roșu 2 JN – Francolor.

naftalinbenzoat de 2-clor-4-nitro-1-benzendiazoniu (formă de sare stabilă) ca în Reactiv NNCD – nr. crt. 74150 FLUKA

ori un echivalent.

Azotat de argint

p-dimetilaminobenzaldehidă

2,5-dimetilfenol

Clorură ferică hexahidrată (FeCl3 6H2O)

Acid clorhidric, soluție 10 % m/v

Substanțe de referință

Substanțele de referință sunt cele indicate în primul paragraf, Scop și obiective. În cazul compușilor de amine, substanțele de referință trebuie să fie ori hidrocloruri (mono sau bi), ori baze libere.

Soluții de referință 0,5 % (m/v)

Se prepară câte o soluție 0,5 % (m/v) din fiecare dintre substanțele de referință din secțiunea 3.20.

Într-un balon cotat de 10 ml se cântăresc 50 mg ± 1 mg substanță de referință.

Se adaugă 5 ml etanol 96 % (3.3) și 250 mg acid ascorbic (3.5).

Se alcalinizează soluția prin adăugarea soluției de amoniac (3.4) pentru a obține un pH aparent de 10 (se verifică cu hârtie indicatoare).

Se adăugă până la 10 ml etanol 96 % (3.3) și se amestecă.

Soluțiile pot fi păstrate o săptămână într-un loc rece și ferit de lumină.

În anumite cazuri, după adăugarea acidului ascorbic și a amoniacului, se poate forma un precipitat. În acest caz trebuie lăsat să se sedimenteze înainte de lucru.

Solvenți de developare

Acetonă – cloroform – toluen (raport volumetric 35:25:40)

Cloroform – ciclohexan – etanol absolut – amoniac 25 % (raport volumetric 80:10:10:1)

Benzen – 2-butanol – apă (raport volumetric 50:25:25). Se agită bine și se folosește faza superioară după separare la temperatura camerei (20 până la 25 °C)

n-butanol – cloroform – reactiv M (raport volumetric 7:70:23). Se separă cu grijă la temperatura camerei (20 până la 25 °C) și se folosește faza inferioară.

Notă

Solvenții de developare conținând amoniac trebuie bine agitați imediat înainte de folosire.

Spray-uri indicatoare

Reactiv diazo

Se prepară o soluție apoasă 5 % (m/v) din reactiv ales (3.14). Această soluție trebuie să fie proaspăt preparată, chiar înainte de folosire.

Reactiv Ehrlich

Se dizolvă 2 g p-diametilaminobenzaldehidă (3.16) în 100 ml acid clorhidric soluție apoasă 10 % (m/v) (3.19).

2,5-dimetilfenol - clorură ferică hexahidrată

Soluție 1: se dizolvă 1 g dimetilfenol (3.17) în 100 ml etanol 96 % (3.3).

Soluție 2: se dizolvă 4 g clorură ferică hexahidratată (3.18) în 100 ml etanol 96 % (3.3).

Pentru developare, aceste soluții sunt pulverizate separat, întâi soluția 1, apoi soluția 2.

Azotat de argint amoniacal

Peste o soluție apoasă de azotat de argint 5 % (m/v) (3.15) se adaugă soluție de amoniac 25 % (3.4), până la dizolvarea precipitatului. Acest reactiv trebuie preparat imediat înainte de folosire.

Reactivul nu se păstrează.

APARATURĂ

Echipament de laborator obișnuit pentru cromatografie în strat subțire.

Capac de plastic sau sticlă astfel construit, încât placa cromatografică să fie înconjurată de azot în timpul apariției petelor și uscării. Această precauție este necesară din cauza susceptibilității la oxidare a anumitor coloranți.

Microseringă de 10 μl, gradată cu diviziuni de 0,2 μl, cu ac cu secțiune pătrată, sau, mai bine, un distribuitor cu repetiție de 50 μl, montat pe un stativ cu clemă, astfel încât placa să fie menținută sub azot.

Plăci cu silicagel pentru cromatografie în strat subțire, gata preparate, de 0,25 mm grosime, format 20 × 20 cm (Macherey și Nagel, Silica G-HR, care au suport de plastic, sau echivalente).

Centrifugă, 4000 rotații/minut.

Eprubete de centrifugă de 10 ml, cu capace filetate căptușite cu PTFE sau echivalent.

PROCEDURĂ

Tratarea probelor

Se îndepărtează primii 2 sau 3 cm din crema scoasă din tub.

Se pun într-o eprubetă de centrifugă (4.3), suflată în prealabil cu azot, următoarele: 300 mg acid ascorbic cu 3 g cremă ori 3 g lichid omogenizat.

Se adaugă cu picătura amoniac 25 % (3.4) până la pH 10. Se adaugă până la 10 ml etanol 96 % (3.3).

Se omogenizează sub azot (3.8), se pune capacul și apoi se centrifughează (la 4000 rotații/min) timp de 10 minute.

Se folosește lichidul supernatant.

Cromatografie

Punctarea plăcilor

Sub atmosferă de azot (3.8), se aplică pe o placă cromatografică (4.1.3) 1 μl din fiecare dintre soluțiile de referință descrise mai sus pe 9 puncte situate la aproximativ 1,5 cm unul de celălalt, de-a lungul unei linii situate la aproximativ 1,5 cm de muchia plăcii.

Aceste pete de soluție de referință sunt dispuse după cum urmează:

În plus, la punctele 10 și 11 se aplică câte 2 μl din soluția de probă obținută conform secțiunii 5.1.

Se menține placa sub azot (3.8) până în momentul în care este cromatografiată.

Developare

Se pune placa într-un tanc în prealabil suflat cu azot (3.8), saturat cu unul dintre cei patru solvenți (3.22), și se lasă la developat la temperatura camerei (20 până la 25 °C), în întuneric, până când frontul de solvent migrează aproximativ 15 cm față de linia de bază.

Se îndepărtează placa și se usucă sub azot (3.8) la temperatura camerei.

Pulverizare

Se pulverizează placa imediat cu una dintre cele patru soluții specificate la punctul 3.23.

Identificare

Se compară valoarea Rf și culoarea obținută pentru probă cu acelea ale substanțelor de referință cromatografiate.

Tabelul I exemplifică valorile Rf și culorile pentru fiecare substanță, în funcție de solvent și de indicatorul folosit.

În cazul unei identificări incerte, confirmarea poate fi uneori realizată printr-o metodă de fixare, adăugând la extractul de probă soluția de substanță de referință corespunzătoare.

Estimare semicantitativă

Se compară vizual intensitatea petelor pentru fiecare substanță identificată la 5.2.4. cu un șir adecvat de concentrații ale substanțelor de referință.

În cazul în care concentrația uneia sau a mai multor substanțe găsite în probă este excesivă, se diluează extractul de probă și se repetă măsurarea.

TABELUL I

Valori Rf și culorile obținute imediat după pulverizare

EXAMINARE PRIN CROMATOGRAFIE BIDIMENSIONALĂ ÎN STRAT SUBȚIRE

Acest procedeu bidimensional de cromatografie în strat subțire necesită folosirea unor standarde și reactivi suplimentari.

Substanțe și soluții de referință suplimentare

β-naftol (β-N)

2-aminofenol (OAP)

3-aminofenol (MAP)

4-aminofenol (PAP)

2-nitro-1,4-fenilendiamină (2-NPPD)

4-nitro-1,2-fenilendiamină (4-NOPD)

Se prepară câte o soluție 0,5 % (m/v) din fiecare substanță de referință suplimentară, conform descrierii de la punctul 3.21.

Solvent de developare suplimentar

Acetat de etil – ciclohexan – soluție de amoniac 25 % (raport volumetric 65:30:0,5)

Sistem de indicație suplimentar

Se pune un vas de sticlă într-un tanc de developare pentru cromatografie în strat subțire, se adaugă aproximativ 2 g iod cristalizat și se acoperă vasul cu un capac potrivit.

Cromatografie

Se desenează două linii, așa cum se arată în figura 1, pe suprafața absorbantă a unei plăci în strat subțire (4.1.3).

Sub atmosferă de azot (4.1.1), se pun 1 până la 4 μl extract (5.1) la punctul de bază 1 (figura 1), care este la 2 cm față de cele două laturi. Cantitatea de extract depinde de intensitatea petelor de pe cromatogramele 5.2.

Coloranții de oxidare identificați sau presupuși a fi identificați la 5.2 se împart între punctele 2 și 3 (figura 1); distanța între puncte este de 1,5 cm. Se pun 2 μl din fiecare soluție de referință – cu excepția DAP, din care trebuie puși 6 μl. Se operează în atmosferă de azot (6.4.2).

Se repetă operația de la 6.4.3. la punctele de bază 4 și 5 (figura 1) și se păstrează placa sub atmosferă de azot până în momentul în care este cromatografiată (distanța între puncte 1,5 cm).

Se suflă cu azot (3.8) tancul cromatografic și se pune în acesta o cantitate adecvată de solvent de developare 3.22.2. Se pune placa (6.4.4) în tanc și se developează în prima direcție de eluție (figura 1), la întuneric.

Se eluează până când frontul de solvent atinge linia marcată pe placă (aproximativ 13 cm).

Se scoate placa din tanc și se plasează în tancul cromatografic în prealabil suflat cu azot pentru evaporarea solventului de eluție pentru cel puțin 60 de minute.

Cu o eprubetă gradată, se pune o cantitate adecvată de solvent de eluție (6.2) într-un tanc suflat cu azot (3.8), se pune placa rotită cu 90o în tanc (6.4.6) și se cromatografiază în a doua direcție (de asemenea în întuneric), până când frontul de solvent atinge linia desenată pe suprafața absorbantă. Se scoate placa din tanc și se evaporă solventul de eluție în aer.

Se pune placa pentru 10 minute în tancul cromatografic cu vapori de iod (6.3) și se interpretează cromatograma bidimensională folosind valorile Rf și valorile culorilor pentru substanțele de referință cromatografiate în același timp (tabelul II este un ghid al valorilor Rf și al culorilor).

Notă

Pentru a obține colorarea maximă a petelor, se lasă cromatograma expusă în atmosferă timp de 30 de minute după developare.

Prezența coloranților de oxidare găsiți la 6.4.8 poate fi confirmată definitiv prin repetarea operațiilor descrise de la 6.4.1 la 6.4.8 și adăugând la punctul de bază 1 în vârful cantității de extract specificate la 6.4.2 1 μl din substanțele de referință identificate la 6.4.8. Dacă nu se găsește nici un alt punct în comparație cu cromatograma obținută la 6.4.8, interpretarea cromatogramei 6.4.8 este corectă.

TABEL II

Culoarea substanțelor de referință după cromatografiere șidevelopare cu vapori de iod

Figura 1

Direcția II

1,5 cm

5 cm

Direcția I

13 cm

1,5 cm

2 cm

2 cm

13 cm

5 cm

IDENTIFICAREA ȘI DETERMINAREA AZOTITULUI

IDENTIFICARE

OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta metodă este adecvată pentru identificarea azotitului în produsele cosmetice, în special în creme și paste.

PRINCIPIU

Prezența azotitului este indicată prin formarea de derivați colorați cu 2-aminobenzaldehidă fenilhidrazonă (Nitrin®).

REACTIVI

Toți reactivii trebuie să fie de puritate analitică.

Acid sulfuric diluat: se diluează 2 ml acid sulfuric concentrat (d_4_(20) = 1·84) cu 11 ml apă distilată.

Acid clorhidric diluat: se diluează 1 ml acid clorhidric concentrat (d_4_(20) = 1·84) cu 11 ml apă distilată.

Metanol

O soluție de 2-aminobenzaldehidă fenilhidrazonă (reactiv Nitrin®) în metanol.

Se cântăresc 2,0 g de Nitrin® și se transferă cantitativ într-un balon cotat de 100 ml. Se adaugă cu picătura 4 ml acid clorhidric diluat (3.2) și se amestecă. Se umple până la semn cu metanol și se amestecă până când soluția devine complet limpede. Se depozitează soluția într-un flacon din sticlă brună (4.3).

APARATURĂ

Pahare de laborator de 50 ml

Balon cotat de 100 ml

Flacon din sticlă brună de 125 ml

Sticlă de ceas de 10 × 10 cm

Spatule de plastic

Hârtie de filtru de 10 × 10 cm

PROCEDURĂ

Se întinde uniform o parte din probă pe sticla de ceas (4.4), stratul ce acoperă suprafața nedepășind 1 cm.

Se îmbibă hârtia de filtru (4.6) cu apă distilată. Se așază peste probă și se presează hârtia de filtru cu spatula de plastic (4.5).

Se lasă un minut și se aplică pe centrul hârtiei de filtru:

două picături de acid sulfuric diluat (3.1),

urmate de 2 picături soluție de Nitrin® (3.4).

După 5 până la 10 secunde, se îndepărtează hârtia de filtru și se examinează la lumină naturală. Prezența azotitului este indicată prin colorarea în roșu purpuriu.

Dacă conținutul de azotit este scăzut, colorația roșu purpuriu devine galbenă după 5 până la 15 secunde. Această schimbare de culoare are loc numai după 1-2 minute, atunci când azotitul este prezent în cantitate mare.

OBSERVAȚIE

Intensitatea culorii roșu purpuriu și durata de timp înainte de modificarea în galben poate da o indicație asupra conținutului de azotit în amestec.

DETERMINARE

DOMENIU DE APLICARE

Metoda descrie determinarea azotitului în produsele cosmetice.

DEFINIȚIE

Conținutul de azotit în probă, determinat conform acestei metode, este exprimat în procente (%) masice de azotit de sodiu.

PRINCIPIU

După diluarea probei în apă și limpezire, azotitul prezent este făcut să reacționeze cu sulfonilamidă și N-1-naftiletilendiamină și se măsoară densitatea optică a culorii obținute, la 538 nm.

REACTIVI

Toți reactivii trebuie să fie de puritate analitică.

Reactivi de limpezire: acești reactivi nu pot fi folosiți după mai mult de o săptămână de la preparare.

Reactiv Carrez I:

Se dizolvă 106 g cianoferat de potasiu, (II) K4Fe(CN)6·3H2O, în apă distilată și se diluează cu apă până la 1000 ml.

Reactiv Carrez II:

Se dizolvă 299,5 g acetat de zinc, Zn (CH3COO)2·2H2O și 30 ml acid acetic glacial în apă distilată și apoi se diluează cu apă până la 1000 ml.

Soluție de azotit de sodiu:

Într-un balon cotat de 1000 ml se dizolvă 0,500 g azotit de sodiu în apă distilată și se diluează cu apă până la semn. Se diluează 10,0 ml din această soluție standard stoc până la 500 ml; 1 ml din această ultimă soluție = 10 micrograme de NaNO2.

Soluție de hidroxid de sodiu 1 n

Soluție de hidroclorură de sulfanilamidă 0,2 %

Se dizolvă 2,0 g sulfanilamidă în 800 ml apă la cald. Se răcește și se adaugă 100 ml acid clorhidric concentrat, agitându-se în acest timp. Se adaugă apă până la 1000 ml.

Acid clorhidric 5 n

Reactiv N-1-naftil:

Această soluție trebuie preparată în ziua în care se folosește. Se dizolvă 0,1 g dihidroclorură de N-1- naftiletilendiamină în apă și se diluează cu apă până la 100 ml.

APARATURĂ

Balanță analitică

Baloane cotate de 100, 250, 500 și 1000 ml

Pipete gradate sau de gaze

Cilindri gradați de 100 ml

Hârtie de filtru cutată, fără azotit, diametru 15 cm

Baie de apă

Spectrofotometru cu cuvă optică de lungime de cale 1 cm

pH-metru

Microbiuretă de 10 ml

Pahare de laborator de 250 ml.

PROCEDURĂ

Se cântăresc, cu o precizie de 0,1 mg, aproximativ 0,5 g (m grame) din proba omogenizată; se transferă cantitativ cu apă distilată fierbinte într-un pahar de 250 ml (5.10) și se completează cu apă distilată fierbinte până la 150 ml. Se pune paharul (5.10) în baia de apă (5.6) la 80 °C pentru o jumătate de oră. În această perioadă, conținutul se agită din când în când.

Se răcește la temperatura camerei și se adaugă succesiv, sub agitare, 2 ml reactiv Carrez I (4.1.1) și 2 ml reactiv Carrez II (4.1.2).

Se adaugă soluție de hidroxid de sodiu 1 n (4.3) pentru a aduce pH-ul la 8,3 (se folosește pH-metrul (5.8)]. Se transferă cantitativ conținutul într-un balon cotat de 250 ml (5.2) și se aduce la semn cu apă distilată.

Se amestecă conținutul și se filtrează prin hârtie de filtru cutată (5.5).

Se pipetează (5.3) într-un balon cotat de 100 ml (5.2) o porțiune adecvată (V ml) de filtrat limpede, dar nu mai mult de 25 ml, și se adaugă apă distilată până la un volum de 60 ml.

După amestecare, se adaugă 10,0 ml soluție hidroclorură de sulfanilamidă (4.4) și 6,0 ml de acid clorhidric 5 n (4.5). Se amestecă și se lasă să stea 5 minute. Se adaugă 2,0 ml reactiv N-1-naftil (4.6), se amestecă și se lasă să stea 3 minute. Se diluează cu apă până la semn și se amestecă.

Se prepară probă-martor prin repetarea operațiilor 6.5 și 6.6 fără adăugarea reactivului N-1-naftil (4.6).

Se măsoară (5.7) densitatea optică la 538 nm a soluției obținute la 6.6 folosind soluția-martor (6.7) ca referință.

Se citește de pe graficul de etalonare (6.10) conținutul de azotit de sodiu în micrograme per 100 ml de soluție (m1 micrograme) care corespunde densității optice măsurate la punctul 6.8.

Folosind 10 μg per ml soluție azotit de sodiu (4.2), se realizează un grafic de etalonare pentru concentrațiile 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg de azotit de sodiu per 100 ml.

CALCUL

Se calculează conținutului de azotit de sodiu din probă, în procente masice, folosind următoarea formulă:

în care:

mmasa probei analizate, în grame, (6.1),m1conținutul de azotit de sodiu determinat la 6.9, în micrograme,Vnumărul de mililitri de filtrat folosit pentru măsurare (6.5).

Vezi standardul ISO 5725.

Pentru un conținut de aproximativ 0,2 % m/m azotit de sodiu, diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în paralel pe aceeași probă nu trebuie să depășească o valoare absolută de 0,005 %.

IDENTIFICAREA ȘI DETERMINAREA FORMALDEHIDEI LIBERE

OBIECT ȘI DOMENIU DE APLICARE

Prezenta metodă descrie identificarea și două determinări în funcție de prezența sau absența donorilor de formaldehidă. Metoda se aplică tuturor produselor cosmetice.

Identificare

Determinare generală prin colorimetrie cu pentan-2,4-dionă

Prezenta metodă se aplică atunci când formaldehida este utilizată singură sau împreună cu alți conservanți care nu sunt donori de formaldehidă.

În alte situații și dacă rezultatul depășește concentrația maximă admisă, trebuie folosită următoarea metodă de confirmare.

Determinare în prezența donorilor de formaldehidă

În metoda menționată mai sus (1.2), în timpul procesului de formare a derivaților, donorii de formaldehidă se divid și conduc la rezultate care sunt prea mari (formaldehidă combinată și polimerizată).

Este necesară separarea formaldehidei prin cromatografie de lichid.

DEFINIȚIE

Conținutul de formaldehidă liberă al probei, determinat în conformitate cu prezenta metodă, este exprimat în procente masice.

IDENTIFICARE

Principiu

Într-un mediu de acid sulfuric, formaldehida liberă și combinată colorează reactivul Schiff în roz sau mov.

Reactivi

Toți reactivii trebuie să fie de puritate analitică, iar apa trebuie să fie demineralizată.

Fucsină;

Sulfit de sodiu hidratat cu 7 molecule de H2O;

Acid clorhidric concentrat (d = 1,19);

Acid sulfuric, aproximativ 1 M;

Reactiv Schiff:

Într-un pahar se cântăresc 100 mg fucsină (3.2.1.) și se dizolvă în 75 ml apă la 80 °C. După răcire, se adaugă 2,5 g sulfit de sodiu (3.2.2.). Se completează până la 100 ml.

Se utilizează în interval de două săptămâni.

Procedură

Într-un pahar de 10 ml se cântăresc 2 g din probă.

Se adaugă două picături de acid sulfuric (3.2.4) și 2 ml de reactiv Schiff (3.2.5). În momentul folosirii, reactivul trebuie să fie absolut incolor.

Se agită și se lasă în repaus cinci minute.

Dacă în primele cinci minute se observă o tentă roz sau mov, formaldehida este prezentă în exces de 0,01 % și trebuie determinată prin metoda liberă sau combinată (4) și, dacă este necesar, prin procedura (5).

DETERMINARE GENERALĂ PRIN COLORIMETRIE CU PENTAN-2,4-DIONĂ

Principiu

Formaldehida reacționează cu pentan-2,4-dionă în prezența acetatului de amoniu și formează 3,5-diacetil-1,4-dihidrolutidină. Aceasta este extrasă cu 1-butanol și absorbanța extractului este măsurată la 410 nm.

Reactivi

Toți reactivii trebuie să fie de puritate analitică iar apa trebuie să fie demineralizată.

Acetat de amoniu anhidru;

Acid acetic concentrat d420 = 1,05;

Pentan 2,4-dionă proaspăt distilată la presiune redusă 25 mm Hg la 25o - nu ar trebui să absoarbă la 410 nm;

1-Butanol;

Acid clorhidric, 0,1 M;

Acid clorhidric, aproximativ 0,1 M;

Hidroxid de sodiu, 1 M;

Soluție de amidon proaspăt preparată, în conformitate cu European Pharmacopoeia (1 g/50 ml apă), ediția a II-a, 1980, părțile I-VII-1-1;

Formaldehidă 37 - 40 % m/v;

Soluție standard de iod, 0,05 M;

Soluție standard de tiosulfat de sodiu, 0,1 M;

Reactiv pentan-2,4-dionă

Într-un balon cotat de 1000 ml se dizolvă:

150 g acetat de amoniu (4.2.1);

2 ml pentan-2,4-dionă (4.2.3);

3 ml acid acetic (4.2.2).

Se completează cu apă până la semn (pH-ul soluției aproximativ 6,4).

Acest reactiv trebuie să fie proaspăt preparat;

Reactiv (4.2.12) fără pentan-2,4-dionă;

Formaldehidă standard: soluție stoc

Într-un balon cotat se pun 5 g formaldehidă (4.2.9) și se completează cu apă până la 1000 ml.

Se determină concentrația soluției după cum urmează:

Se îndepărtează 10,00 ml; se adaugă 25,00 ml soluție standard de iod (4.2.10) și 10,00 ml soluție de hidroxid de sodiu (4.2.7).

Se lasă să stea 5 minute.

Se acidulează cu 11,00 ml HCl (4.2.5) și se determină excesul de iod cu soluție standard de tiosulfat de sodiu (4.2.11), utilizând ca indicator soluție de amidon (4.2.8).

1 ml iod 0,05 M (4.2.10) consumat este echivalent cu 1,5 mg formaldehidă;

Formaldehidă standard: soluție diluată

Se diluează succesiv cu apă soluția stoc de formaldehidă, până la 1/20 și respectiv 1/100.

1 ml din această soluție conține aproximativ 1 μg formaldehidă.

Se calculează conținutul exact.

Aparatură

Aparatură standard de laborator;

Filtru de separare de faze, Whatman 1 PS (sau echivalent);

Centrifugă;

Baie de apă reglată la 60 °C;

Spectrofotometru;

Cuve de sticlă cu cale optică de 1 cm.

Procedură

Soluție de probă

Într-un balon cotat de 100 ml se cântărește, cu o precizie de 0,001 g, o cantitate (în g) din proba analizată, corespunzătoare unei presupuse cantități de formaldehidă de aproximativ 150 μg.

Se completează până la 100 ml cu apă și se amestecă (soluție S).

[Se verifică valoarea pH-ului, care trebuie să fie apropiat de 6; dacă nu, se diluează cu soluție de acid clorhidric (4.2.6)].

Într-un pahar Erlenmeyer de 50 ml se pun:

10,00 ml soluție S;

5,00 ml reactiv pentan-2,4-dionă (4.2.12);

apă demineralizată până la un volum final de 30 ml.

Soluție de referință

Posibilele interferențe datorate culorii de fond în proba analizată se elimină prin utilizarea acestei soluții de referință:

Într-un pahar Erlenmeyer de 50 ml se pun:

10,00 ml soluție S;

5,00 ml reactiv (4.2.13);

apă demineralizată până la un volum final de 30 ml.

Test-martor

Într-un pahar Erlenmeyer de 50 ml se pun:

5,00 ml reactiv pentan-2,4-dionă (4.2.12);

apă demineralizată până la un volum final de 30 ml.

Determinare

Se agită amestecurile de la 4.4.1, 4.4.2 și 4.4.3. Se introduc paharele Erlenmeyer într-o baie de apă la 60 °C pentru exact 10 minute. Se lasă la răcit într-o baie de apă cu gheață timp de două minute.

Se transferă în pâlnii de separare de 50 ml conținând 10 ml de butanol (4.2.4). Se clătește fiecare pahar cu 3 - 5 ml apă. Se agită puternic amestecul exact 30 de secunde. Se lasă să se separe.

Se filtrează faza de 1-butanol în cuvele de măsurare (4.3.2) printr-un filtru pentru separarea fazelor. De asemenea, se poate folosi centrifugarea (3000 gn timp de cinci minute).

Se măsoară absorbanța A1 la 410 nm a extractului soluției probă de la 4.4.1, față de extractul soluției de referință 4.4.2.

Similar, se măsoară absorbanța A2 a extractului soluției-martor de la 4.4.3 față de 1-butanol.

N.B.:

Toate aceste operații trebuie efectuate într-un interval de timp de 25 minute de la introducerea paharelor Erlenmeyer în baia de apă de 60 °C.

Curba de etalonare

Într-un pahar Erlenmeyer de 50 ml se pun:

5,00 ml soluție standard diluată de la 4.2.15 ;

5,00 ml reactiv pentan-2,4-dionă (4.2.12);

apă demineralizată până la un volum final de 30 ml.

Se continuă conform descrierii de la 4.4.4 și se măsoară absorbanța față de 1-butanol (4.2.4).

Se repetă procedura cu 10, 15, 20 și 25 ml soluție standard diluată (4.2.15).

Pentru a obține valoarea de zero (corespunzătoare colorației reactivilor), se procedează ca la 4.4.4.5.

Se construiește curba de etalonare după scăderea valorii de zero din fiecare din absorbanțele obținute la 4.4.5.1 și 4.4.5.3. Legea lui Beer este valabilă până la un conținut de 30 μg formaldehidă.

Calcul

Se scade A2 din A1 și se citește din curba de etalonare (4.4.5.5) cantitatea C, în μg, de formaldehidă din soluția probă (4.4.1).

Se calculează conținutul de formaldehidă din probă (% m/m) cu ajutorul următoarei formule:

unde

mmasa porțiunii de probă de la punctul 9.

ISO 5725.

Pentru un conținut de formaldehidă de 0,2 %, diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în paralel pe aceeași probă nu trebuie să depășească 0,005 % pentru determinarea prin colorimetrie cu pentan-2,4-dionă.

Dacă determinarea formaldehidei libere conduce la rezultate mai mari decât concentrația maximă stabilită în Directiva 76/768/CEE, de exemplu:

între 0,05 % și 0,2 % într-un produs neetichetat;

mai mare decât 0,2 % în produs, etichetat sau nu,

trebuie să se aplice procedura descrisă la 5.

DETERMINARE ÎN PREZENȚA DONORILOR DE FORMALDEHIDĂ

Principiu

Formaldehida separată este transformată într-un derivat lutidinic galben printr-o reacție cu pentan-2,4-dionă într-un reactor post-coloană și derivatul obținut este determinat prin absorbanță la 420 nm.

Reactivi

Toți reactanții trebuie să fie de puritate analitică, iar apa trebuie să fie demineralizată.

Apă de puritate HPLC sau de calitate echivalentă;

Acetat de amoniu anhidru;

Acid acetic concentrat;

Pentan-2,4-dionă (păstrată la 4 °C);

Fosfat disodic anhidru;

Acid ortofosforic 85 % (d = 1,7);

Metanol de puritate HPLC;

Diclormetan;

Formaldehid 37 - 40 % m/v;

Hidroxid de sodiu, 1 M;

Acid clorhidric, 1 M;

Acid clorhidric, 0,002 M;

Soluție de amidon proaspăt preparată în conformitate cu European Pharmacopoeia (vezi 4.2.8);

Soluție standard de iod, 0,05 M;

Soluție standard de tiosulfat de sodiu, 0,1 M;

Fază mobilă:

Soluție apoasă de fosfat disodic (5.2.5) 0,006 M, corectată cu acid ortofosforic (5.2.6) la un pH de 2,1;

Reactiv post-coloană

Într-un balon cotat de 1000 ml se dizolvă:

62,5 g acetat de amoniu (5.2.2);

7,5 ml acid acetic (5.2.3);

5 ml pentan-2,4-dionă (5.2.4).

Se completează până la 1000 ml cu apă (5.2.1).

Acest reactiv se păstrează ferit de lumină.

Timp de conservare: maximum trei zile la 25 °C.

Nu trebuie să se observe nici o schimbare de culoare;

Formaldehidă standard: soluție stoc

Într-un balon gradat de 1000 ml se toarnă 10 g formaldehidă (5.2.9) și se completează până la 1000 ml cu apă.

Se determină concentrația soluției în modul următor:

Se îndepărtează 5,00 ml; se adaugă 25,00 ml soluție standard de iod (5.2.14) și 10,00 ml soluție de hidroxid de sodiu (5.2.10).

Se lasă în repaus cinci minute.

Se acidulează cu 11,00 ml HCl (5.2.11) și se titrează excesul de soluție standard de iod cu soluție de tiosulfat de sodiu (5.2.15), utilizând ca indicator soluție de amidon.

1 ml soluție de iod (5.2.14) este echivalent cu 1,5 mg formaldehidă;

Formaldehidă standard: soluție diluată

Se diluează soluția stoc la 1/100 din concentrația sa inițială în faza mobilă (5.2.16).

1 ml din această soluție conține aproximativ 37 mg formaldehidă.

Se calculează conținutul exact.

Aparatură

Aparatură standard de laborator;

Pompă HPLC nepulsatorie;

Pompă nepulsatorie de joasă presiune pentru reactiv (sau o a doua pompă HPLC);

Injector cu ciclu de 10 μl;

Reactor post-coloană cu următoarele componente:

+ un balon de 1 l cu trei gâturi;

+ o retortă de 1 l;

+ două coloane Vigreux cu minimum 10 talere, dintre care două răcite cu aer;

+ tub din oțel inoxidabil de 1,6 mm (pentru schimb de căldură) – diametru interior 0,23 mm, lungime = 400 mm;

+ tub din teflon de 1,6 mm – diametru interior 0,30 mm, lungime 5 m (tricotină), vezi apendicele 1;

+ un teu fără volum propriu (tip valco sau echivalent);

+ trei racorduri fără volum propriu;

Sau: un modul post-coloană Applied Biosystems PCRS 520 sau echivalent, echipat cu un reactor de 1 ml;

Filtru cu membrană, dimensiunea porilor 0,45 μm;

Cartuș SEP-PAKR C18, sau echivalent;

Coloane gata preparate:

Bischoff hipersil RP 18 (tip NC referință C25.46 1805)

(5 μm, lungime = 250 mm, diametru interior = 4,6 mm),

sau Dupont, Zorbax ODS

(5 μm, lungime = 250 mm, diametru interior = 4,6 mm),

sau Phase SEP, spherisorb ODS 2

(5 μm, lungime = 250 mm, diametru interior = 4,6 mm);

Pre-coloană

Bischoff K1 hypersil RP 18 (referință K1 G 6301 1805)

(5 μm, lungime = 10 mm, sau echivalent).

Coloana și pre-coloana sunt conectate prin intermediul unui sistem Ecotube (referință A 15020508 Bischoff) sau echivalent.

Se asamblează aparatura (5.3.5) conform schemei bloc din apendicele 2.

Conectorii de după injector trebuie să fie cât mai scurți posibil. În acest caz, tubul din oțel inoxidabil dintre ieșirea reactorului și intrarea detectorului este destinat răcirii amestecului înaintea detecției iar temperatura în detector este necunoscută dar constantă.

Detector cu spectru vizibil UV;

Dispozitiv de înregistrare;

Centrifugă;

Baie ultrasonică;

Agitator vibrator (vortex sau echivalent).

Procedură

Curbă de etalonare

Aceasta se obține prin construirea curbei înălțimilor vârfurilor în funcție de concentrația formaldehidei standard: diluată.

Se prepară soluțiile standard prin diluarea soluției de referință de formaldehidă (5.2.19) cu faza mobilă (5.2.16):

1,00 ml soluție (5.2.19) diluată la 20,00 ml (aproximativ 185 μg/100 ml)

2,00 ml soluție (5.2.19) diluată la 20,00 ml (aproximativ 370 μg/100 ml)

5,00 ml soluție (5.2.19) diluată la 25,00 ml (aproximativ 740 μg/100 ml)

5,00 ml soluție (5.2.19) diluată la 20,00 ml (aproximativ 925 μg/100 ml).

Soluțiile standard sunt păstrate timp de o oră la temperatura laboratorului și trebuie să fie proaspăt preparate.

Linearitatea curbei de etalonare este bună pentru concentrații între 1,00 și 15,00 μg/ml.

Pregătirea probelor

Emulsii (creme, fond de ten, tușuri pentru ochi)

Într-un vas de 100 ml cu dop se cântărește, cu o precizie de 0,001 g, o cantitate din proba analizată (m grame) corespunzătoare unei presupuse cantități de 100 μg formaldehidă. Se adaugă 20,00 ml diclormetan (5.2.8.) și 20,00 ml acid clorhidric (5.2.12), măsurate cu precizie. Se amestecă cu un agitator vibrator (5.3.16) și prin intermediul băii ultrasonice (5.3.15). Se separă cele două faze prin centrifugare (3000 gn timp de două minute). Între timp, se spală un cartuș (5.3.7) cu 2 ml metanol (5.2.7), apoi se condiționează cu 5 ml apă (5.2.1).

Se trec 4 ml din faza apoasă a extractului prin cartușul pregătit, se îndepărtează primii 2 ml și se recuperează fracția următoare.

Loțiuni, șampoane

Într-un vas de 100 ml cu dop se cântărește, cu precizie de 0,001 g, o cantitate din proba analizată (m grame) corespunzătoare unei presupuse cantități de aproximativ 500 μg formaldehidă.

Se completează până la 100 ml cu fază mobilă (5.2.16).

Se filtrează soluția printr-un filtru (5.3.6.) și se injectează sau se trece printr-un cartuș (5.3.7) condiționat ca mai sus (5.4.2.1). Toate soluțiile trebuie injectate imediat după preparare.

Condiții de cromatografiere

debitul fazei mobile: 1 ml/min;

debitul reactivului: 0,5 ml/min;

debitul total la ieșirea din detector: 1,5 ml/min;

volumul injectat: 10 μl;

temperatura eluției: În cazul separărilor dificile, se introduce coloana într-o baie de gheață topită: se așteaptă ca temperatura să se stabilizeze (15 - 20 min);

temperatura reacției post-coloană: 100 °C;

detecție: 420 nm.

N.B.:

Întregul sistem cromatografic și post-coloană trebuie spălat abundent cu apă după utilizare. Dacă sistemul nu este folosit mai mult de două zile, această spălare trebuie urmată de una cu metanol (5.2.7). Înainte de recondiționarea sistemului trebuie trecută apă prin el, pentru evitarea recristalizării.

Calcul

Emulsii: (5.4.2.1):

Conținutul de formaldehidă în % (m/m):

Loțiuni, șampoane:

În acest caz, formula devine:

unde:

ISO 5725.

Pentru un conținut de formaldehidă de 0,05 %, diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în paralel pe aceeași probă nu trebuie să depășească 0,001 %.

Pentru un conținut de formaldehidă de 0,2 %, diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în paralel pe aceeași probă nu trebuie să depășească 0,005 %.

DETERMINAREA REZORCINOLULUI ÎN ȘAMPOANE ȘI LOȚIUNI PENTRU PĂR

OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta metodă stabilește determinarea prin cromatografie de gaze a rezorcinolului în șampoane și loțiuni de păr. Metoda este adecvată pentru concentrații în probă de la 0,1 la 2,0 % procente masice.

DEFINIȚIE

Conținutul de rezorcinol din probă determinat conform acestei metode este exprimat în procente masice.

PRINCIPIU

Rezorcinolul și 3,5-dihidroxitoluenul, (5-metilrezorcinol) adăugat ca standard intern, sunt separate din probă prin cromatografie în strat subțire. Amândoi componenții sunt izolați prin decuparea petelor lor de pe placa de strat subțire și extragere cu metanol. În final, compuși extrași sunt uscați, sililați și determinați prin cromatografie de gaze.

REACTIVI

Toți reactivii trebuie să fie de puritate analitică.

Acid clorhidric 25 % (m/m)

Metanol

Etanol 96 % (v/v)

Folii cu silicagel pentru cromatografie în strat subțire gata preparate (plastic sau aluminiu) cu indicator fluorescent. Se dezactivează după cum urmează: se pulverizează cu apă foliile acoperite în prealabil cu silice, până se glazurează. Se lasă plăcile pulverizate să se usuce în aer la temperatura camerei pentru una până la trei ore.

Notă:

Dacă plăcile nu sunt dezactivate, se pot produce pierderi de rezorcinol prin adsorbția ireversibilă pe silice.

Solvent de developare; acetonă – cloroform – acid acetic (raport volumetric 20:75:5)

Soluție standard de rezorcinol; se dizolvă 400 mg rezorcinol în 100 ml etanol 96 % (4.3) (1 ml corespunde la 4000 μg rezorcinol).

Soluția standard intern: se dizolvă 400 mg 3,5-dihidroxitoluen (DHT) în 100 ml etanol 96 % (4.3) (1 ml corespunde la 4000 μg DHT).

Amestec standard: într-un balon cotat de 100 ml se amestecă 10 ml soluție 4.6 și 10 ml soluție 4.7, se aduce la semn cu etanol 96 % (4.3) și se amestecă (1 ml corespunde la 400 μg rezorcinol și 400 μg DHT).

Agenți de sililare

N, O-bi(trimetilsilil) trifluoroacetamidă (BSTFA)

Hexametildisilazan (HMDS)

Trimetilclorosilan (TMCS)

APARATURĂ

Echipament uzual pentru cromatografia în strat subțire și cromatografia de gaze

Sticlărie de laborator

PROCEDURĂ

Pregătirea probei

Într-un pahar de 150 ml se cântărește cu precizie probă din produs (m grame) care conține aproximativ 20 până la 50 mg rezorcinol.

Se acidifiază cu acid clorhidric (4.1) până când amestecul devine acid (este nevoie de aproximativ 2 până la 4 ml), se adaugă 10 ml (40 mg DHT) soluție standard intern (4.7) și se amestecă. Se transferă cu etanol (4.3) într-un balon cotat de 100 ml, se aduce la semn cu etanol și se amestecă.

Se aplică 250 μl soluție (6.1.2) pe o folie de silice dezactivată (4.4) sub formă de linie continuă de aproximativ 8 cm lungime. Linia trebuie să fie cât se poate de subțire.

Se aplică 250 μl amestec standard (4.8) pe aceeași placă și în același mod (6.1.3).

Se picură pe două puncte de pe linia de pornire câte 5 μl din fiecare dintre soluțiile 4.6 și 4.7 pentru a ajuta la localizare după developarea plăcii.

Se developează placa într-un tanc necăptușit (nesaturat) umplut cu solvent de developare 4.5 până când frontul de solvent atinge 12 cm de la linia de pornire; de obicei aceasta durează 45 de minute. Se usucă placa în aer și se localizează zona de rezorcinol/DHT sub lumină UV (254 nm). Cei doi componenți au aproximativ aceleași valori Rf. Se marchează benzile cu creionul la 2 mm distanță de marginea întunecată exterioară a benzilor. Se îndepărtează aceste zone și se colectează adsorbantul fiecărei benzi într-un flacon de 10 ml.

Se extrag adsorbantul conținând proba și cel ce conține amestecul standard, fiecare în modul următor:

Se adaugă 2 ml metanol (4.2) și se extrage timp de o oră sub agitare continuă. Se filtrează amestecul și se repetă extracția timp de alte 15 minute cu 2 ml metanol.

Se combină extractele și se evaporă solventul prin uscare peste noapte într-un exicator cu vid umplut cu desicant adecvat. Nu se încălzește deloc.

Se sililează reziduurile (6.1.8) conform 6.1.9.1 sau 6.1.9.2.

Cu o microseringă se adaugă peste amestec 200 μl BSTFA (4.9.1) și se lasă 12 ore într-un vas închis, la temperatura camerei.

Cu o microseringă se adaugă 200 μl HMDS (4.9.2) și 100 μl TMCS (4.9.3) și se încălzește amestecul timp de 30 de minute la 60 °C într-un vas închis. Se răcește amestecul.

Cromatografie de gaze

Condiții de cromatografiere

Coloana trebuie să realizeze o rezoluție, R, egală sau mai bună decât 1,5, unde:

în care:

r1 și r2timpii de retenție pentru două vârfuri, în minute,w1 și w2lățimea acelorași vârfuri la jumătatea înălțimii, în mm,dviteza graficului, în mm pe minut.

S-au găsit adecvate următoarele condiții pentru cromatografia de gaze și pentru coloană:

Pentru reglările debitelor de hidrogen și aer se urmează instrucțiunile fabricantului.

Se injectează 1până la 3 μl din soluțiile obținute la 6.1.9 în cromatograful de gaze. Se efectuează 5 injectări pentru fiecare soluție (6.1.9), se măsoară ariile vârfurilor, se face media acestora și se calculează raportul ariilor vârfurilor: S = aria vârfului pentru rezorcinol/aria vârfului pentru DHT.

CALCUL

Concentrația de rezorcinol din probă, exprimată în procente de masă (% m/m), este dată de:

în care:

Mmasa probei analizate, în grame (6.1.1),S probăraportul mediu al ariilor vârfurilor, conform 6.2.2, pentru probă,S amestec standardraportul mediu al ariilor vârfurilor, conform 6.2.2, pentru amestecul standard.

Vezi standardul ISO 5725.

Pentru un conținut de rezorcinol de aproximativ 0,5 %, diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în paralel pe aceeași probă nu trebuie să depășească o valoare absolută de 0,025 %.

DETERMINAREA METANOLULUI FAȚĂ DE ETANOL SAU 2-PROPANOL

OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta metodă descrie analiza prin cromatografie de gaze a metanolului în toate tipurile de produse cosmetice (inclusiv aerosoli).

Pot fi determinate niveluri relative de la 0 până la 10 %.

DEFINIȚIE

Conținutul de metanol determinat conform acestei metode este exprimat în procente masice de metanol față de etanol sau 2-propanol.

PRINCIPIU

Determinarea se realizează prin cromatografie de gaze.

REACTIVI

Toți reactivii trebuie să fie de puritate analitică.

Metanol

Etanol absolut

2-propanol

Cloroform, liber de alcooli prin spălare cu apă

APARATURĂ

Cromatograf de gaze:

cu detector catarometru pentru probele cu aerosoli,

cu detector cu ionizare cu flacără pentru probele non-aerosoli.

Baloane cotate de 100 ml

Pipete de 2 ml, 20 ml, 0 până la 1 ml

Microseringi de 0 până la 100 μl și 0 până la 5 μl

JO L 383, 31.12.1980, p. 27.

PROCEDURĂ

Pregătirea probei

JO L 383, 31.12.1980, p. 27.

Probele din produsele fără aerosoli se prelevează conform susmenționatului capitol II, se diluează cu apă până la un nivel de 1-2 % etanol sau 2-propanol și apoi se analizează prin cromatografie de gaze în condițiile de la punctul 6.2.2.

Cromatografie de gaze

Pentru probele cu aerosoli se folosește detectorul catarometru.

Coloana este umplută cu 10 % Hallcomid M18 pe Chromosorb WAW cu 100-200 de ochiuri.

Coloana trebuie să realizeze o rezoluție, R, egală sau mai bună decât 1,5, unde:

în care:

r1 și r2timpii de retenție pentru două vârfuri, în minute,w1 și w2lățimea acelorași vârfuri la jumătatea înălțimii, în mm,dviteza graficului, în mm pe minut.

Următoarele condiții permit atingerea acestei rezoluții:

Măsurarea ariilor vârfurilor poate fi îmbunătățită prin integrare electronică.

Pentru probele fără aerosoli

Coloana se umple cu Chromosorb 105 sau Porapak QS și se folosește un detector cu ionizare cu flacără.

Coloana trebuie să realizeze o rezoluție, R, egală sau mai bună decât 1,5 unde:

în care:

r1 și r2timpii de retenție pentru două vârfuri, în minute,w1 și w2lățimea acelorași vârfuri la jumătatea înălțimii, în mm,d′viteza graficului, în mm pe minut.

Condițiile care permit obținerea acestei rezoluții sunt:

GRAFIC STANDARD

Pentru procedura prin cromatografie de gaze 6.2.1 (coloană Hallcomid M18), se folosesc următoarele amestecuri standard. Aceste amestecuri se prepară prin măsurare cu pipeta, dar se determină cantitatea exactă prin cântărirea imediată a pipetei sau flaconului după fiecare adăugare.

Se injectează 2 până la 3 μl în cromatograf, în condițiile de la punctul 6.2.1.

Se calculează raportul ariilor vârfurilor (metanol/etanol) sau (metanol/2-propanol) pentru fiecare amestec. Se trasează graficul standard folosind:

Pentru procedura prin cromatografie de gaze 6.2.2 (Porapak QS sau Chromosorb 105) se folosesc următoarele amestecuri standard. Aceste amestecuri se prepară prin măsurare cu pipeta, dar se determină cantitatea exactă prin cântărirea imediată a pipetei sau flaconului după fiecare adăugare.

Se injectează 2 până la 3 μl în cromatograf, în condițiile de la punctul 6.2.2.

Se calculează raportul ariilor vârfurilor (metanol/etanol) sau (metanol/2-propanol) pentru fiecare amestec. Se trasează graficul standard folosind:

Graficul standard trebuie să fie o linie dreaptă.

Vezi standardul ISO 5725.

Pentru un conținut de metanol de 5 % față de etanol sau 2-propanol, diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în paralel nu trebuie să depășească 0,25 %.

Apendice 1

INSTRUCȚIUNI PENTRU TRICOTINĂ

ACCESORII NECESARE

O bobină din lemn:

diametrul exterior 5 cm, cu un orificiu de 1,5 cm diametru prin centru. Se introduc 4 cuie din oțel (după cum se arată în figurile 1 și 2). Distanța dintre două cuie trebuie să fie de 1,8 cm și ele trebuie să fie la 0,5 cm de orificiu;

un ac rigid (de tipul croșetei) pentru a lega tubul de teflon;

un tub din teflon de 1,6 mm având diametrul interior de 0,3 mm și lungimea de 5 m.

PROCEDURĂ

Pentru a începe tricotina, tubul din teflon trebuie poziționat de la partea superioară a bobinei spre partea inferioară prin orificiul central (lăsând în jur de 10 cm din tub să iasă în afară în partea inferioară a bobinei, permițând lanțului să poată fi tras în timpul procesului), apoi se înfășoară tubul în jurul celor patru cuie, ca în figura 3.

Părțile superioară și inferioară ale tricotinei se protejează cu inele metalice și șuruburi de compresiune; trebuie avut grijă să nu se spargă teflonul când se trage tare. Se înfășoară tubul în jurul fiecărui cui, pentru a doua oară și se fac bucle după cum urmează:

cu ajutorul cârligului, se ridică tubul inferior peste tubul superior (vezi figura 4). Se repetă acest proces pe fiecare dintre cele patru cuie, în ordine (1, 2, 3, 4 în sens invers acelor de ceasornic), până când se realizează 5 m sau lungimea dorită pentru tricotină.

Se lasă aproximativ 10 cm din tub pentru a închide lanțul. Se poziționează tubul prin fiecare dintre cele patru bucle și se trage ușor, pentru a închide capătul lanțului.

N.B.

Tricotina fabricată pentru reactorul post-coloană este disponibilă pe piață (Supelco).

Diagrama schematică a bobinei

Figura 1

Figura 3

1 cm

Primul tub

10 cm

Figura 4

Al doilea tub

Pentru a forma o buclă, se ridică tubul inferior (linia neîntreruptă) peste cel de-al doilea tub (linia întreruptă)

5 cm

Figura 2

1,8 cm

1,5 cm

Figura 5

110o

Apendicele 2

Efluent

Reactanți”

în absența persulfaților (A), prin adăugarea de acid sulfuric diluat la o porțiune acidificată din soluția probă (B.4.1), în urma căreia se formează un precipitat alb de sulfat de bariu. Prezența ionilor de bariu în probă (B.4.1) este încă o dată confirmată prin cromatografie pe hârtie în modul descris mai sus (B.5);

când peroxidul de bariu și persulfații sunt prezenți simultan (B.4.2), prin asimilarea reziduului din soluție (B.4.2) într-o bază; după dizolvarea în acid clorhidric, prezența ionilor de bariu este confirmată în soluția topiturii (B.4.2.3) prin cromatografie pe hârtie și prin precipitarea sulfatului de bariu.

clorbenzensulfonat de 3-nitro-1-benzendiazoniu (forma de sare stabilă) ca în Roșu 2 JN – Francolor.

naftalinbenzoat de 2-clor-4-nitro-1-benzendiazoniu (formă de sare stabilă) ca în Reactiv NNCD – nr. crt. 74150 FLUKA

două picături de acid sulfuric diluat (3.1),

urmate de 2 picături soluție de Nitrin® (3.4).

150 g acetat de amoniu (4.2.1);

2 ml pentan-2,4-dionă (4.2.3);

3 ml acid acetic (4.2.2).

10,00 ml soluție S;

5,00 ml reactiv pentan-2,4-dionă (4.2.12);

apă demineralizată până la un volum final de 30 ml.

10,00 ml soluție S;

5,00 ml reactiv (4.2.13);

apă demineralizată până la un volum final de 30 ml.

5,00 ml reactiv pentan-2,4-dionă (4.2.12);

apă demineralizată până la un volum final de 30 ml.

5,00 ml soluție standard diluată de la 4.2.15 ;

5,00 ml reactiv pentan-2,4-dionă (4.2.12);

apă demineralizată până la un volum final de 30 ml.

între 0,05 % și 0,2 % într-un produs neetichetat;

mai mare decât 0,2 % în produs, etichetat sau nu,

62,5 g acetat de amoniu (5.2.2);

7,5 ml acid acetic (5.2.3);

5 ml pentan-2,4-dionă (5.2.4).

+ un balon de 1 l cu trei gâturi;

+ o retortă de 1 l;

+ două coloane Vigreux cu minimum 10 talere, dintre care două răcite cu aer;

+ tub din oțel inoxidabil de 1,6 mm (pentru schimb de căldură) – diametru interior 0,23 mm, lungime = 400 mm;

+ tub din teflon de 1,6 mm – diametru interior 0,30 mm, lungime 5 m (tricotină), vezi apendicele 1;

+ un teu fără volum propriu (tip valco sau echivalent);

+ trei racorduri fără volum propriu;

Sau: un modul post-coloană Applied Biosystems PCRS 520 sau echivalent, echipat cu un reactor de 1 ml;

Bischoff hipersil RP 18 (tip NC referință C25.46 1805)(5 μm, lungime = 250 mm, diametru interior = 4,6 mm),

sau Dupont, Zorbax ODS(5 μm, lungime = 250 mm, diametru interior = 4,6 mm),

sau Phase SEP, spherisorb ODS 2(5 μm, lungime = 250 mm, diametru interior = 4,6 mm);

1,00 ml soluție (5.2.19) diluată la 20,00 ml (aproximativ 185 μg/100 ml)

2,00 ml soluție (5.2.19) diluată la 20,00 ml (aproximativ 370 μg/100 ml)

5,00 ml soluție (5.2.19) diluată la 25,00 ml (aproximativ 740 μg/100 ml)

5,00 ml soluție (5.2.19) diluată la 20,00 ml (aproximativ 925 μg/100 ml).

debitul fazei mobile: 1 ml/min;

debitul reactivului: 0,5 ml/min;

debitul total la ieșirea din detector: 1,5 ml/min;

volumul injectat: 10 μl;

temperatura eluției: În cazul separărilor dificile, se introduce coloana într-o baie de gheață topită: se așteaptă ca temperatura să se stabilizeze (15 - 20 min);

temperatura reacției post-coloană: 100 °C;

detecție: 420 nm.

cu detector catarometru pentru probele cu aerosoli,

cu detector cu ionizare cu flacără pentru probele non-aerosoli.

O bobină din lemn:diametrul exterior 5 cm, cu un orificiu de 1,5 cm diametru prin centru. Se introduc 4 cuie din oțel (după cum se arată în figurile 1 și 2). Distanța dintre două cuie trebuie să fie de 1,8 cm și ele trebuie să fie la 0,5 cm de orificiu;

un ac rigid (de tipul croșetei) pentru a lega tubul de teflon;

un tub din teflon de 1,6 mm având diametrul interior de 0,3 mm și lungimea de 5 m.

cu ajutorul cârligului, se ridică tubul inferior peste tubul superior (vezi figura 4). Se repetă acest proces pe fiecare dintre cele patru cuie, în ordine (1, 2, 3, 4 în sens invers acelor de ceasornic), până când se realizează 5 m sau lungimea dorită pentru tricotină.

Apendice 1INSTRUCȚIUNI PENTRU TRICOTINĂ

Apendice 1

INSTRUCȚIUNI PENTRU TRICOTINĂ

ACCESORII NECESARE

O bobină din lemn:

diametrul exterior 5 cm, cu un orificiu de 1,5 cm diametru prin centru. Se introduc 4 cuie din oțel (după cum se arată în figurile 1 și 2). Distanța dintre două cuie trebuie să fie de 1,8 cm și ele trebuie să fie la 0,5 cm de orificiu;

un ac rigid (de tipul croșetei) pentru a lega tubul de teflon;

un tub din teflon de 1,6 mm având diametrul interior de 0,3 mm și lungimea de 5 m.

PROCEDURĂ

Pentru a începe tricotina, tubul din teflon trebuie poziționat de la partea superioară a bobinei spre partea inferioară prin orificiul central (lăsând în jur de 10 cm din tub să iasă în afară în partea inferioară a bobinei, permițând lanțului să poată fi tras în timpul procesului), apoi se înfășoară tubul în jurul celor patru cuie, ca în figura 3.

Părțile superioară și inferioară ale tricotinei se protejează cu inele metalice și șuruburi de compresiune; trebuie avut grijă să nu se spargă teflonul când se trage tare. Se înfășoară tubul în jurul fiecărui cui, pentru a doua oară și se fac bucle după cum urmează:

cu ajutorul cârligului, se ridică tubul inferior peste tubul superior (vezi figura 4). Se repetă acest proces pe fiecare dintre cele patru cuie, în ordine (1, 2, 3, 4 în sens invers acelor de ceasornic), până când se realizează 5 m sau lungimea dorită pentru tricotină.

Se lasă aproximativ 10 cm din tub pentru a închide lanțul. Se poziționează tubul prin fiecare dintre cele patru bucle și se trage ușor, pentru a închide capătul lanțului.

N.B.

Tricotina fabricată pentru reactorul post-coloană este disponibilă pe piață (Supelco).

Diagrama schematică a bobinei

Figura 1

Figura 3

1 cm

Primul tub

10 cm

Figura 4

Al doilea tub

Pentru a forma o buclă, se ridică tubul inferior (linia neîntreruptă) peste cel de-al doilea tub (linia întreruptă)

5 cm

Figura 2

1,8 cm

1,5 cm

Figura 5

110o

O bobină din lemn:diametrul exterior 5 cm, cu un orificiu de 1,5 cm diametru prin centru. Se introduc 4 cuie din oțel (după cum se arată în figurile 1 și 2). Distanța dintre două cuie trebuie să fie de 1,8 cm și ele trebuie să fie la 0,5 cm de orificiu;

un ac rigid (de tipul croșetei) pentru a lega tubul de teflon;

un tub din teflon de 1,6 mm având diametrul interior de 0,3 mm și lungimea de 5 m.

cu ajutorul cârligului, se ridică tubul inferior peste tubul superior (vezi figura 4). Se repetă acest proces pe fiecare dintre cele patru cuie, în ordine (1, 2, 3, 4 în sens invers acelor de ceasornic), până când se realizează 5 m sau lungimea dorită pentru tricotină.

Apendicele 2

Apendicele 2

Efluent

Reactanți”

Tabelul 1

Tabelul 2

Tabelul 3

Tabelul 5

Tabelul 6

Tabelul 7

Tabelul 11

Tabelul 12

Tabelul 13

Tabelul 14