Regulamentul de punere în aplicare (UE) 2018/150 al Comisiei din 30 ianuarie 2018 de modificare a Regulamentului de punere în aplicare (UE) 2016/1240 în ceea ce privește metodele de analiză și evaluare calitativă a laptelui și produselor lactate eligibile pentru intervenția publică și pentru ajutoarele pentru depozitarea privată

având în vedere Tratatul privind funcționarea Uniunii Europene,

având în vedere Regulamentul (UE) nr. 1306/2013 al Parlamentului European și al Consiliului din 17 decembrie 2013 privind finanțarea, gestionarea și monitorizarea politicii agricole comune și de abrogare a Regulamentelor (CEE) nr. 352/78, (CE) nr. 165/94, (CE) nr. 2799/98, (CE) nr. 814/2000, (CE) nr. 1290/2005 și (CE) nr. 485/2008 ale Consiliului, în special articolul 62 alineatul (2) litera (i),

Regulamentul delegat (UE) 2016/1238 al Comisiei și Regulamentul de punere în aplicare (UE) 2016/1240 al Comisiei stabilesc norme în ceea ce privește intervenția publică și ajutoarele pentru depozitarea privată. Regulamentul (CE) nr. 273/2008 al Comisiei stabilește metodele care trebuie aplicate pentru a se evalua dacă laptele și produsele lactate îndeplinesc cerințele de eligibilitate prevăzute în regulamentele menționate, referitoare la intervenția publică și la ajutoarele pentru depozitarea privată.

Având în vedere evoluțiile tehnice ale metodologiei utilizate pentru analiza și evaluarea calitativă a laptelui și produselor lactate, ar trebui aduse modificări substanțiale în scopul simplificării și al furnizării unor referiri actualizate la standardele ISO. Din motive de claritate și eficiență și având în vedere amploarea și natura tehnică a modificărilor aduse dispozițiilor Regulamentului (CE) nr. 273/2008, dispozițiile relevante ale regulamentului respectiv ar trebui încorporate în Regulamentul de punere în aplicare (UE) 2016/1240.

Pentru a se asigura respectarea uniformă a noilor standarde și metode în toate statele membre, ar trebui să se acorde laboratoarelor o perioadă de timp suficientă pentru revizuirea procedurilor și aplicarea metodelor actualizate.

Prin urmare, Regulamentul de punere în aplicare (UE) 2016/1240 ar trebui modificat în consecință.

Din motive de securitate juridică, Regulamentul (CE) nr. 273/2008 ar trebui abrogat.

Măsurile prevăzute în prezentul regulament sunt conforme cu avizul Comitetului pentru organizarea comună a piețelor agricole,

Regulamentul de punere în aplicare (UE) 2016/1240 se modifică după cum urmează:

Articolul 4 se modifică după cum urmează:

alineatul (1) se modifică după cum urmează:

litera (d) se înlocuiește cu următorul text:

litera (e) se înlocuiește cu următorul text:

alineatul (2) se înlocuiește cu următorul text:

litera (d) se înlocuiește cu următorul text:

litera (e) se înlocuiește cu următorul text:

Se introduce următorul articol 60a:

Anexele se modifică în conformitate cu anexa la prezentul regulament.

Regulamentul (CE) nr. 273/2008 se abrogă.

Prezentul regulament intră în vigoare în a șaptea zi de la data publicării în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene.

Adoptat la Bruxelles, 30 ianuarie 2018.Pentru ComisiePreședinteleJean-Claude Juncker

ANEXĂ

Anexele la Regulamentul de punere în aplicare (UE) nr. 2016/1240 se modifică după cum urmează:

Anexa IV se modifică după cum urmează:

în partea I punctul 2, paragraful al doilea se înlocuiește cu următorul text:

Fiecare probă este evaluată individual. Nu este permisă repetarea prelevării probelor sau reevaluarea.;

se introduce următoarea parte Ia:

PARTEA IA

Metodele de analiză a untului nesărat pentru intervenție publică

Tabel de punctaj

În anexa V se introduce următoarea parte Ia:

PARTEA IA

Metode de analiză a laptelui praf degresat pentru intervenție publică

Standardul Internațional IDF 135B/1991. Lapte și produse lactate. Caracteristicile preciziei metodelor de analiză. Prezentare generală a procedurii de studiu în colaborare.

Se adaugă următoarele anexe:

Produsele Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) și Resolyte® pH 5-7 și pH 6-8 (BDH, Merck) s-au dovedit deosebit de adecvate pentru obținerea separării necesare a γ-cazeinelor.

Regulamentul (CE) nr. 882/2004 al Parlamentului European și al Consiliului din 29 aprilie 2004 privind controalele oficiale efectuate pentru a asigura verificarea conformității cu legislația privind hrana pentru animale și produsele alimentare și cu normele de sănătate animală și de bunăstare a animalelor (JO L 165, 30.4.2004, p. 1).

Anexa IV se modifică după cum urmează:

în partea I punctul 2, paragraful al doilea se înlocuiește cu următorul text:

se introduce următoarea parte Ia:

În anexa V se introduce următoarea parte Ia:

Se adaugă următoarele anexe:

în partea I punctul 2, paragraful al doilea se înlocuiește cu următorul text:

se introduce următoarea parte Ia:

Tabelul 1

Tabelul 2

Tabelul 3

Apendicele I

LAPTE PRAF DEGRESAT: DETERMINAREA CANTITATIVĂ A FOSFATIDILSERINEI ȘI A FOSFATIDILETANOLAMINEI

Metodă: HPLC în fază inversă

OBIECTIV ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Metoda descrie o procedură de determinare cantitativă a fosfatidilserinei (PS) și a fosfatidiletanolaminei (PE) din laptele praf degresat (SMP) și este adecvată pentru determinarea substanțelor solide din zară în SMP.

DEFINIȚIE

PRINCIPIUL METODEI

Extracția aminofosfolipidelor cu metanol din lapte praf reconstituit. Determinarea PS și a PE ca derivați ai o-ftaldialdehidei (OPA) prin HPLC în fază inversă (RP) și prin detectare cu fluorescență. Cuantificarea conținutului de PS și de PE din proba de testat prin referire la o probă-standard conținând o cantitate cunoscută de PEDP.

REACTIVI

Toți reactivii sunt de calitate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puțin echivalentă, cu excepția cazurilor în care se specifică altfel.

Material-standard: PEDP cu o puritate de cel puțin 99 %

Notă: Materialul-standard se depozitează la – 18 °C.

Reactivi pentru prepararea probei-standard și a probei de testat

Metanol de calitate HPLC

Cloroform de calitate HPLC

Monoclorhidrat de triptamină

Reactivi pentru derivarea o-ftaldialdehidei

Hidroxid de sodiu, soluție apoasă 12 M

Acid boric, soluție apoasă 0,4 M ajustată la pH de 10,0 cu hidroxid de sodiu (4.3.1)

2-mercaptoetanol

o-ftaldialdehidă (OPA)

Solvenți de eluție HPLC

Solvenții de eluție se prepară utilizând reactivi de calitate HPLC.

Apă de calitate HPLC

Metanol cu puritate fluorimetrică testată

Tetrahidrofuran

Fosfat diacid de sodiu

Acetat de sodiu

Acid acetic.

APARATURĂ

Cântar analitic, capabil să cântărească până la cea mai apropiată valoare de 1 mg, cu lizibilitate de 0,1 mg

Pahare Berzelius, cu capacitate de 25 și 100 ml

Pipete, capabile să dozeze 1 și 10 ml

Agitator magnetic

Pipete gradate, capabile să dozeze 0,2, 0,5 și 5 ml

Flacoane gradate, cu capacitate de 10, 50 și 100 ml

Seringi, cu capacitate de 20 și 100 μl

Baie cu ultrasunete

Centrifugă, capabilă să funcționeze la 27000 × g

Fiole de sticlă, cu capacitate de aproximativ 5 ml

Cilindru gradat, cu capacitate de 25 ml

pH-metru, cu precizie de 0,1 unități de pH

Echipament HPLC

Sistem de pompare pe bază de gradient, capabil să funcționeze la 1,0 ml/min la 200 bari

Aparat de prelevare de probe automată cu posibilitate de derivare

Încălzitor cu coloană, capabil să mențină coloana la 30 °C ± 1 °C

Detector cu fluorescență, capabil să funcționeze la o lungime de undă de excitație de 330 nm și la o lungime de undă de emisie de 440 nm

Integrator sau software de procesare de date capabil să măsoare aria vârfului

O coloană LiChrospher® – 100 (250 × 4,6 mm) sau o coloană echivalentă umplută cu octadecilsilan (C 18), particule de 5 μm.

PRELEVAREA PROBELOR

Prelevarea probelor se realizează în conformitate cu standardul ISO 707.

PROCEDURA

Prepararea soluției-standard interne

Se cântăresc 30,0 ± 0,1 mg de monoclorhidrat de triptamină (4.2.3) într-un flacon gradat de 100 ml (5.6) și se completează până la marcaj cu metanol (4.2.1).

Se pipetează 1 ml (5.3) din această soluție într-un flacon gradat de 10 ml (5.6) și se completează până la marcaj cu metanol (4.2.1) pentru a se obține o concentrație de triptamină de 0,15 mM

Prepararea soluției conținând proba de testat

Se cântăresc 1,000 ± 0,001 g de probă de SMP într-un pahar Berzelius de 25 ml (5.2). Se adaugă 10 ml de apă distilată cu temperatura de 40 °C ± 1 °C cu o pipetă (5.3) și se amestecă cu un agitator magnetic (5.4) timp de 30 de minute pentru a se dizolva orice concrețiuni.

Se pipetează 0,2 ml (5.5) din laptele reconstituit într-un flacon gradat de 10 ml (5.6), se adaugă 100 μl din soluția de triptamină de 0,15 mM (7.1) cu ajutorul unei seringi (5.7) și se completează până la volum cu metanol (4.2.1). Se amestecă cu grijă prin răsturnare și se expune ultrasunetelor (5.8) timp de 15 min

Se centrifughează (5.9) la 27000 × g timp de 10 minute și se colectează supernatantul într-o fiolă de sticlă (5.10)

Notă: Soluția conținând proba de testat se depozitează la 4 °C până la finalizarea analizei HPLC.

Prepararea soluției-standard externe

Se cântăresc 55,4 g de PEDP (4.1) într-un flacon gradat de 50 ml (5.6) și se adaugă aproximativ 25 ml de cloroform (4.2.2) cu ajutorul unui cilindru gradat (5.11). Se încălzește flaconul astupat la 50 °C ± 1 °C și se amestecă cu grijă până când PEDP se dizolvă. Flaconul se răcește la 20 °C, se completează până la volum cu metanol (4.2.1) și se amestecă prin răsturnare

Se pipetează 1 ml (5.3) din această soluție într-un flacon gradat de 100 ml (5.6) și se completează până la volum cu metanol (4.2.1). Se pipetează 1 ml (5.3) din această soluție într-un flacon gradat de 10 ml (5.6), se adaugă 100 μl (5.7) de soluție de triptamină de 0,15 mM (7.1) și se completează până la volum cu metanol (4.2.1). Se amestecă prin răsturnare

Notă: Soluția conținând proba de referință se depozitează la 4 °C până la efectuarea analizei HPLC.

Prepararea reactivului de derivare

Se cântăresc 25,0 ± 0,1 mg de OPA (4.3.4) într-un flacon gradat de 10 ml (5.6), se adaugă 0,5 ml (5.5) de metanol (4.2.1) și se amestecă cu grijă pentru ca OPA să se dizolve. Se completează până la marcaj cu soluție de acid boric (4.3.2) și se adaugă 20 μl de 2-mercaptoetanol (4.3.3) cu o seringă (5.7).

Notă: Reactivul de derivare se depozitează la 4 °C într-o fiolă de sticlă maro și este stabil timp de o săptămână.

Determinarea prin HPLC

Solvenți de eluție (4.4)

Solventul A: Soluție de fosfat diacid de sodiu 0,3 mM și soluție de acetat de sodiu 3 mM (ajustată cu acid acetic până la pH 6,5 ± 0,1): metanol: tetrahidrofuran = 558:440:2 (V/V/V)

Solventul B: metanol

Gradient de eluare recomandat:

Notă: Este posibil ca gradientul de eluție să necesite o ușoară modificare pentru a se obține rezoluția prezentată în figura 1.

Temperatura coloanei: 30 °C.

Volumul de injectare: 50 μl reactiv de derivare și 50 μl soluție conținând proba.

Echilibrarea coloanei

Se pornește sistemul în fiecare zi, se irigă coloana cu solvent B 100 % timp de 15 minute, apoi se reglează la A:B = 40:60 și se echilibrează la 1 ml/min timp de 15 minute. Se efectuează o funcționare de probă prin injectarea de metanol (4.2.1).

Notă: Înainte de o depozitare pe termen lung, coloana se irigă cu metanol: cloroform = 80:20 (V/V) timp de 30 de minute.

Determinarea conținutului de PS + PE din proba de testat

Secvența de analize cromatografice se efectuează păstrând constantă perioada între efectuări pentru a se obține timpi de reținere constanți. Soluția-standard externă (7.3) se injectează la fiecare 5-10 soluții conținând proba de testat pentru a se calcula factorul de răspuns

Notă: Coloana se curăță prin irigare cu solvent B 100 % (7.5.1) timp de cel puțin 30 de minute la fiecare 20-25 de funcționări.

Modul de integrare

Vârful PEDP

PEDP este eluat ca un singur vârf. Se determină aria vârfului prin integrare depresiune-la-depresiune.

Vârful triptaminei

Triptamina este eluată ca un singur vârf (figura 1). Se determină aria vârfului prin integrare depresiune-la-depresiune.

Grupurile de vârfuri ale PS și PE

În condițiile descrise (figura 1), PS eluează sub forma a două vârfuri principale parțial incomplete precedate de un vârf minor. PE eluează sub forma a trei vârfuri principale parțial incomplete. Se determină întreaga arie a fiecărui grup de vârfuri stabilindu-se linia de bază ca în figura 1.

CALCULAREA ȘI EXPRIMAREA REZULTATELOR

Conținutul de PS și PE din proba de testat se calculează după cum urmează:

C = 55,36 × [(A2)/(A1)] × [(T1)/(T2)]

unde:

PRECIZIA METODEI

Notă: Valorile repetabilității au fost calculate conform Standardului Internațional IDF (*).

Repetabilitatea

Derivația standard relativă a repetabilității, care exprimă variabilitatea rezultatelor analitice independente obținute de același operator utilizând aceeași aparatură în aceleași condiții pe aceeași probe de testat și într-un interval de timp scurt nu trebuie să depășească 2 % relativ. În cazul în care se obțin două determinări în aceste condiții, diferența relativă dintre cele două rezultate nu trebuie să fie mai mare de 6 % din media aritmetică a rezultatelor.

Reproductibilitatea

În cazul în care se obțin două determinări de către operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită în condiții diferite pentru analizarea aceleiași probe de testat, diferența relativă dintre cele două rezultate nu trebuie să fie mai mare de 11 % din media aritmetică a rezultatelor.

REFERINȚE

Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids. Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988).

Figura 1

Profilul HPLC al derivaților OPA ai fosfatidilserinei (PS) și ai fosfatidiletanolaminei (PE) în extractul de metanol al laptelui praf degresat reconstituit. Se raportează modul de integrare a vârfurilor PS, PE și al triptaminei (standard intern)

Minutes

Fluorescență (unități arbitrare)

Tabelul 1

Apendicele II

DETECTAREA ZERULUI ÎNCHEGAT DIN LAPTELE PRAF DEGRESAT DESTINAT DEPOZITĂRII PUBLICE PRIN DETERMINAREA CAZEINMACROPEPTIDELOR PRIN CROMATOGRAFIE ÎN MEDIU LICHID DE ÎNALTĂ PERFORMANȚĂ (HPLC)

OBIECT ȘI DOMENIU DE APLICARE

Această metodă permite detectarea zerului închegat din laptele praf degresat destinat depozitării publice prin determinarea cazeinmacropeptidelor.

REFERINȚĂ

Standardul internațional ISO 707 – Lapte și produse lactate – Orientări privind prelevarea de probe.

DEFINIȚIE

Conținutul de materii solide compuse din zer închegat se definește ca procent masic, astfel cum este determinat de conținutul de cazeinmacropeptide prin procedura descrisă.

PRINCIPIU

Reconstituirea laptelui praf degresat, îndepărtarea lipidelor și a proteinelor cu acid tricloracetic, urmată de centrifugare sau de filtrare;

Determinarea cantității de cazeinmacropeptide (CMP) din supernatant prin cromatografie în mediu lichid de înaltă performanță (HPLC);

Evaluarea rezultatelor obținute pentru probe în raport cu probele-standard constând din lapte praf degresat cu sau fără adăugarea unui procent cunoscut de pudră de zer.

REACTIVI

Toți reactivii sunt de calitate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puțin echivalentă.

Soluție de acid tricloracetic

Se dizolvă 240 g de acid tricloracetic (CCl3COOH) în apă și se completează până la 1000 ml. Soluția trebuie să fie limpede și incoloră.

Soluția-eluent, pH 6,0

Se dizolvă 1,74 g de fosfat acid de potasiu (K2HPO4), 12,37 g de fosfat diacid de potasiu (KH2PO4) și 21,41 g de sulfat de sodiu (Na2SO4) în aproximativ 700 ml de apă. În cazul în care este necesar, se ajustează până la pH 6,0 cu ajutorul unei soluții de acid fosforic sau de hidroxid de potasiu.

Se completează până la 1000 ml cu apă și se omogenizează.

Notă: Compoziția eluentului poate fi actualizată pentru se conforma certificatului standardelor sau recomandărilor producătorului materialului de umplere a coloanei.

Soluția-eluent se filtrează înainte de utilizare printr-o membrană filtrantă având pori cu diametrul de 0,45 μm.

Solvent de irigare

Se amestecă un volum de acetonitril (CH3CN) cu nouă volume de apă. Amestecul se filtrează înainte de utilizare printr-o membrană filtrantă având pori cu diametrul de 0,45 μm.

Notă: Se poate utiliza orice alt solvent de irigare cu efect bactericid care nu scade eficiența rezoluției coloanei.

Probele-standard

Lapte praf degresat care îndeplinește cerințele prezentului regulament (adică [0])

Același lapte praf degresat, modificat cu 5 % (m/m) zer închegat praf cu compoziție standard (adică [5]).

APARATURĂ

Cântar analitic

Opțional, centrifugă capabilă să atingă o forță de centrifugare de 2200 g, prevăzută cu tuburi de centrifugare astupate, cu o capacitate de aproximativ 50 ml

Agitator mecanic

Agitator magnetic

Coloane de sticlă, cu diametrul de aproximativ 7 cm

Filtre de hârtie, cu filtrare medie, cu diametrul de aproximativ 12,5 cm

Echipament de filtrare din sticlă prevăzut cu membrană filtrantă cu diametrul porilor de 0,45 μm

Pipete gradate permițând dozarea a 10 ml (ISO 648, clasa A sau ISO/R 835) sau un sistem de dispersare capabil să furnizeze 10,0 ml în două minute

Sistem de dispersare capabil să furnizeze 20,0 ml de apă la o temperatură de aproximativ 50 °C

Baie de apă termostatică, reglată la 25 ± 0,5 °C

Echipament pentru HPLC, format din:

Pompă

Injector, manual sau automat, cu o capacitate de 15-30 μl

Două coloane TSK 2000-SW în serie (lungime de 30 cm, diametru intern de 0,75 cm) sau coloane echivalente (de exemplu TSK 2000-SWxl singură, Agilent Technologies Zorbax GF 250 singură) și o precoloană (3 cm × 0,3 cm) umplute cu material I 125 sau cu un material cu eficiență echivalentă

Cuptor cu coloană termostatic, reglat la 35 ± 1 °C

Detector UV cu lungime de undă variabilă care permite măsurători la 205 nm cu o sensibilitate de 0,008 Å

Integrator capabil să realizeze integrare depresiune-la-depresiune

Notă: Se poate lucra cu coloane păstrate la temperatura camerei, dar puterea lor de rezoluție este ușor mai mică. În acest caz, temperatura nu trebuie să varieze cu mai puțin de ± 5 °C în nicio serie de analize.

PRELEVAREA PROBELOR

Prelevarea probelor se face în conformitate cu procedura prevăzută în standardul internațional ISO 707. Totuși, statele membre pot utiliza o altă metodă de prelevare a probelor, cu condiția ca aceasta să fie conformă cu principiile standardului menționat anterior

Probele se depozitează în condiții care împiedică orice deteriorare sau modificare a compoziției

PROCEDURA

Pregătirea probei de testat

Se transferă laptele praf într-un recipient cu o capacitate aproximativ dublă față de volumul laptelui praf, prevăzut cu un capac etanș pentru aer. Recipientul se închide imediat. Laptele praf se amestecă bine prin răsturnări repetate ale recipientului.

Porția de testat

Se cântăresc 2,000 + 0,001 g din proba de testat într-un tub de centrifugare (6.2.) sau într-un flacon astupat în mod corespunzător (50 ml).

Îndepărtarea lipidelor și a proteinelor

Se adaugă 20,0 ml de apă caldă (50 C) la porția de testat. Se dizolvă pudra agitându-se timp de cinci minute cu ajutorul unui agitator mecanic (6.3). Tubul se introduce în baia de apă (6.10) și se lasă să se echilibreze la 25 °C

Se adaugă 10,0 ml de soluție de acid tricloracetic (5.1.) la aproximativ 25 °C în două minute, amestecându-se puternic cu ajutorul agitatorului magnetic (6.4). Tubul se introduce într-o baie de apă (6.10) și se lasă timp de 60 de minute

Se centrifughează (6.2) timp de 10 minute la 2200 g sau se filtrează printr-o hârtie (6.6), eliminându-se primii 5 ml de filtrat

Determinarea cromatografică

Se injectează 15-30 μl de supernatant sau filtrat (8.3.3) măsurate cu precizie în dispozitivul HPLC (6.11) funcționând la un debit de 1,0 ml de soluție-eluent (5.2) per minut

Nota 1. Se poate utiliza un alt debit, în funcție de diametrul intern al coloanelor utilizate sau de instrucțiunile producătorului coloanei.

Nota 2. Coloanele se clătesc cu apă în timpul fiecărei întreruperi. Soluția-eluent nu se lasă niciodată în coloane (5.2).

Înainte de orice întrerupere care durează mai mult de 24 de ore, coloanele se clătesc cu apă și apoi se spală cu soluție (5.3) timp de cel puțin trei ore la un debit de 0,2 ml per minut.

Rezultatele analizei cromatografice a probei de testat [E] se obțin sub forma unei cromatograme în care fiecare vârf se identifică după timpul său de retenție RT, după cum urmează.

Alegerea coloanei (coloanelor) poate afecta în mod considerabil timpii de retenție ai fiecărui vârf.

Integratorul (6.11.6) calculează automat aria A a fiecărui vârf:

Este esențial să se examineze aspectul fiecărei cromatograme înainte de interpretarea cantitativă pentru a se detecta orice anomalii cauzate fie de funcționarea necorespunzătoare a aparaturii sau a coloanelor, fie de originea sau natura probei analizate.

În cazul în care există dubii, analiza se repetă.

Calibrarea

Probelor-standard (5.4) li se aplică cu exactitate procedura descrisă de la punctul 8.2 la punctul 8.4.2.

Se utilizează soluții proaspăt preparate, întrucât CMP se degradează într-un mediu tricloracetic de 8 %. Pierderea este estimată la 0,2 % per oră la 30 °C.

Înainte de determinarea cromatografică a probelor, coloanele se condiționează prin injectarea repetată a probei-standard (5.4.2) în soluție (8.5.1) până când aria vârfului și timpul de retenție al acestuia pentru CMP sunt constante.

Factorul de răspuns R se determină prin injectarea aceluiași volum de filtrați (8.5.1) utilizat și pentru probe

EXPRIMAREA REZULTATELOR

Metodă de calcul și formule

Calcularea factorilor de răspuns R:

unde:

unde:

Calcularea ariei relative a vârfurilor probei [E]:

SII[E] = RII × AII[E]

SIII[E] = RIII × AIII[E]

SIV[E] = RIV × AIV[E]

unde:

Calcularea timpului relativ de retenție al vârfului III pentru proba [E]:

RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5])

unde:

Experimentele au demonstrat că există o relație liniară între timpul relativ de retenție al vârfului III, adică RRTIII [E] și procentul de zer praf adăugat până la 10 %.

RRTIII [E] este < 1,000 în cazul în care conținutul de zer este > 5 %;

RRTIII [E] este ≥ 1,000 în cazul în care conținutul de zer este ≤ 5 %.

Incertitudinea permisă pentru valorile RRTIII este de ± 0,002.

În mod normal, valoarea RRTIII [0] deviază puțin de la 1,034. În funcție de starea coloanelor, valoarea se poate apropia de 1,000, dar întotdeauna trebuie să fie mai mare decât această valoare.

Calcularea procentului de zer închegat praf din probă:

W = SIII[E] – [1, 3 + (SIII[0] – 0, 9)]

unde:

Precizia procedurii

Repetabilitatea

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate simultan sau în succesiune rapidă de către același analist utilizând aceeași aparatură pe material de testare identic nu trebuie să depășească 0,2 % m/m.

Reproductibilitatea

Diferența dintre două rezultate singulare și independente, obținute în două laboratoare diferite cu material de testare identic nu trebuie să depășească 0,4 % m/m.

Interpretare

Se presupune că zerul este absent în cazul în care aria relativă a vârfului III, SIII [E] exprimată în grame de zer închegat per 100 g de produs este ≤ 2,0 + (SIII[0] – 0,9)

unde

În cazul în care aria relativă a vârfului III, SIII [E] este > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) și aria relativă a vârfului II, SII [E] ≤ 160, se determină conținutul de zer închegat conform indicațiilor de la punctul 9.2.

În cazul în care aria relativă a vârfului III, SIII [E] este > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) și aria relativă a vârfului II, SII [E] ≤ 160, se determină conținutul total de proteine (P %); apoi se examinează graficele 1 și 2.

Datele obținute în urma analizei probelor de lapte praf degresat nemodificat cu un conținut total de proteine mare sunt reprezentate în graficele 1 și 2.

Linia continuă reprezintă regresia liniară, ai cărei coeficienți se calculează prin metoda celor mai mici pătrate.

Linia dreaptă punctată marchează limita superioară a ariei relative a vârfului III, cu probabilitatea ca aceasta să nu fie depășită în 90 % dintre cazuri.

Ecuațiile liniilor drepte punctate din graficele 1 și 2 sunt:

respectiv unde:

Aceste ecuații sunt echivalente cu cifra 1,3 menționate la punctul 9.2.

Diferența (T1 și T2) dintre aria relativă SIII [E] determinată și aria relativă SIII se calculează după cum urmează: T1 = SIII[E] – [(0,376 P% – 10,7) + (SIII[0] – 0,9)]T2 = SIII[E] – [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] – 0,9)]

Conținutul de zer închegat se calculează cu ajutorul formulei următoare: W = T2 + 0,91

unde:

0,91 este distanța pe axa verticală dintre linia dreaptă continuă și linia dreaptă punctată.

Vârf II

Lapte praf degresat

conținut total de proteine (%)

Vârf III

Vârf III

Lapte praf degresat

Reconstituirea laptelui praf degresat, îndepărtarea lipidelor și a proteinelor cu acid tricloracetic, urmată de centrifugare sau de filtrare;

Determinarea cantității de cazeinmacropeptide (CMP) din supernatant prin cromatografie în mediu lichid de înaltă performanță (HPLC);

Evaluarea rezultatelor obținute pentru probe în raport cu probele-standard constând din lapte praf degresat cu sau fără adăugarea unui procent cunoscut de pudră de zer.

Pompă

Injector, manual sau automat, cu o capacitate de 15-30 μl

Două coloane TSK 2000-SW în serie (lungime de 30 cm, diametru intern de 0,75 cm) sau coloane echivalente (de exemplu TSK 2000-SWxl singură, Agilent Technologies Zorbax GF 250 singură) și o precoloană (3 cm × 0,3 cm) umplute cu material I 125 sau cu un material cu eficiență echivalentă

Cuptor cu coloană termostatic, reglat la 35 ± 1 °C

Detector UV cu lungime de undă variabilă care permite măsurători la 205 nm cu o sensibilitate de 0,008 Å

Integrator capabil să realizeze integrare depresiune-la-depresiune

SII[E] = RII × AII[E]

SIII[E] = RIII × AIII[E]

SIV[E] = RIV × AIV[E]

RRTIII [E] este < 1,000 în cazul în care conținutul de zer este > 5 %;

RRTIII [E] este ≥ 1,000 în cazul în care conținutul de zer este ≤ 5 %.

Tabelul 1

Tabelul 2

Tabelul 3

Tabelul 4

Tabelul 5

Tabelul 6

Tabelul 7

Apendicele III

DETERMINAREA MATERIILOR SOLIDE COMPUSE DIN ZER ÎNCHEGAT ÎN LAPTELE PRAF DEGRESAT

SCOP: DETECTAREA ADĂUGĂRII DE MATERI SOLIDE COMPUSE DIN ZER ÎNCHEGAT ÎN LAPTELE PRAF DEGRESAT

REFERINȚE: STANDARDUL INTERNAȚIONAL ISO 707

DEFINIȚIE

Conținutul de materii solide compuse din zer închegat este definit ca procentul masic astfel cum este determinat prin intermediul conținutului de cazeinmacropeptide prin procedura descrisă.

PRINCIPIU

Probele sunt analizate pentru a determina cazeinmacropeptida A printr-o procedură care implică cromatografie în mediu lichid de înaltă performanță cu fază inversată (procedură HPLC). Evaluarea rezultatelor se face prin referire la probe-standard formate din lapte praf degresat care conțin sau nu un procent cunoscut de zer praf. Rezultatele mai mari de 1 % (m/m) indică prezența materiilor solide compuse din zer închegat.

REACTIVI

Toți reactivii sunt de calitate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puțin echivalentă. Acetonitrilul trebuie să fie de calitate spectroscopică sau de calitate HPLC.

Soluție de acid tricloracetic

Se dizolvă 240 g de acid tricloracetic (CCl3COOH) în apă și se completează până la 1000 ml. Soluția trebuie să fie limpede și incoloră.

Eluenții A și B

Eluentul A: Într-un flacon gradat de 1000 ml se introduc 150 ml acetonitril (CH3CN), 20 ml de izopropanol (CH3CHOHCH3) și 1,00 ml de acid trifluoracetic (TFA, CF3COOH). Se completează cu apă până la 1000 ml.

Eluentul B: Într-un flacon gradat de 1000 ml se introduc 550 ml de acetonitril, 20 ml de izopropanol și 1,00 ml de TFA. Se completează cu apă până la 1000 ml. Soluția-eluent se filtrează înainte de utilizare printr-o membrană filtrantă având pori cu diametrul de 0,45 μm.

Conservarea coloanei

După analize, coloana se irigă cu eluentul B (prin intermediul unui gradient), iar apoi se irigă cu acetonitril (prin intermediul unui gradient, timp de 30 de minute). Coloana se păstrează în acetonitril.

Probele-standard

Lapte praf degresat care îndeplinește cerințele pentru depozitare publică [adică (0)].

Același lapte praf degresat modificat cu 5 % (m/m) zer închegat praf cu compoziție standard (adică [5]).

Același lapte praf degresat, modificat cu 50 % (m/m) zer închegat praf cu compoziție standard (adică [50]).

APARATURĂ

Cântar analitic

Opțional, centrifugă capabilă să atingă o forță de centrifugare de 2200 g, prevăzută cu tuburi de centrifugare astupate, cu o capacitate de aproximativ 50 ml

Agitator mecanic

Agitator magnetic

Coloane de sticlă, cu diametrul de aproximativ 7 cm

Filtre de hârtie, cu filtrare medie, cu diametrul de aproximativ 12,5 cm

Echipament de filtrare din sticlă prevăzut cu membrană filtrantă cu diametrul porilor de 0,45 μm

Pipete gradate, permițând dozarea a 10 ml (ISO 648, clasa A sau ISO/R 835) sau un sistem de dispersare capabil să furnizeze 10,0 ml în două minute

Sistem de dispersare capabil să furnizeze 20,0 ml de apă la o temperatură de aproximativ 50 °C

Baie de apă termostatică, reglată la 25 ± 0,5 °C

Echipament pentru HPLC, format din:

Sistem binar de pompare pe bază de gradient

Injector, manual sau automat, cu o capacitate de 100 μl

Coloană Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (lungime 25 cm, diametru intern 0,46 cm) sau o coloană echivalentă cu fază inversată pe bază de silice cu pori largi

Cuptor cu coloană termostatic, reglat la 35 ± 1 °C

Detector UV cu lungime de undă variabilă care permite măsurători la 210 nm (în cazul în care este necesar, se poate utiliza o lungime de undă mai mare, de până la 220 nm) cu o sensibilitate de 0,02 Å

Integrator capabil să stabilească integrarea la linia de bază comună sau depresiune-la-depresiune

Notă: Operarea coloanei la temperatura camerei este posibilă cu condiția ca temperatura camerei să nu fluctueze cu mai mult de 1 °C, în caz contrar, există variații prea mari ale timpului de retenție al CMPA.

PRELEVAREA PROBELOR

Prelevarea probelor se face în conformitate cu procedura prevăzută în standardul internațional ISO 707. Totuși, statele membre pot utiliza o altă metodă de prelevare a probelor, cu condiția ca aceasta să fie conformă cu principiile standardului menționat anterior

Probele se depozitează în condiții care împiedică orice deteriorare sau modificare a compoziției.

PROCEDURA

Pregătirea probei de testat

Se transferă laptele praf într-un recipient cu o capacitate aproximativ dublă față de volumul laptelui praf, prevăzut cu un capac etanș pentru aer. Recipientul se închide imediat. Laptele praf se amestecă bine prin răsturnări repetate ale recipientului.

Porția de testat

Se cântăresc 2,00 ± 0,001 g din proba de testat într-un tub de centrifugare (6.2.) sau într-un flacon adecvat astupat (50 ml).

Notă: În cazul amestecurilor, se cântărește o astfel de probă de testat încât porția conținând proba degresată să corespundă la 2,00 g.

Îndepărtarea lipidelor și a proteinelor

Se adaugă 20,0 ml de apă caldă (50 °C) la porția de testat. Se dizolvă pudra agitându-se timp de cinci minute cu ajutorul unui agitator mecanic (6.3). Tubul se introduce în baia de apă (6.10) și se lasă să se echilibreze la 25 °C

Se adaugă 10,0 ml de soluție de acid tricloracetic la aproximativ 25 °C (5.1) în mod constant pe parcursul a două minute, în timp ce se amestecă energic cu ajutorul unui agitator magnetic (6.4). Tubul se introduce într-o baie de apă (6.10) și se lasă timp de 60 de minute

Se centrifughează (6.2) 2200 g timp de 10 minute sau se filtrează prin hârtie (6.6), eliminându-se primii 5 ml de filtrat.

Determinarea cromatografică

Metoda HPLC cu fază inversă exclude posibilitatea de a avea rezultate fals pozitive din cauza prezenței zarei praf acidulate.

Înainte de efectuarea analizei HPLC cu fază inversă se optimizează condițiile de gradient. Pentru sistemele pe bază de gradient care au un volum mort de aproximativ 6 ml (volum de la punctul în care solvenții se întâlnesc până la volumul buclei injectorului, inclusiv) timpul de retenție de 26 ± 2 minute pentru CMP A este optim. Sistemele pe bază de gradient care au un volum mort mai mic (de ex. 2 ml) trebuie să utilizeze valoarea de 22 de minute ca timp optim de retenție

Se iau soluții din probele-standard (5.4) fără și cu zer închegat 50 %.

Se injectează 100 μl de supernatant sau de filtrat (8.3.3) în dispozitivul HPLC care funcționează în condițiile de gradient de explorare din tabelul 1.

Comparația celor două cromatograme trebuie să evidențieze localizarea vârfului CMPA.

Utilizând formula redată mai jos, compoziția inițială a solventului de utilizat pentru gradientul normal (a se vedea 8.4.3) poate fi calculată % B = 10 – 2,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6)*30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6)*1,11

Unde:

Se iau soluțiile conținând probele de testat

Se injectează 100 μl de supernatant sau de filtrat (punctul 8.3.3) măsurat cu exactitate în dispozitivul HPLC care funcționează la un debit de 1,0 ml de soluție-eluent (5.2) per minut.

Compoziția eluentului la începutul analizei se obține de la 8.4.2. În mod normal este apropiată de A:B = 76:24 (5.2). Imediat după injectare se pornește un gradient liniar, rezultatul fiind un procent al B cu 5 % mai mare după 27 de minute. Ulterior, se pornește un gradient liniar care aduce compoziția eluentului la 90 % B în cinci minute. Această compoziție este menținută timp de cinci minute, după care compoziția este modificată cu ajutorul unui gradient liniar în decurs de cinci minute până se ajunge la compoziția inițială. În funcție de volumul intern al sistemului de pompare, următoarea injectare se poate face la 15 minute după ce se obțin condițiile inițiale.

Nota 1. Timpul de retenție al CMPA trebuie să fie de 26 ± 2 minute. Acesta se poate obține prin modificarea condițiilor inițiale și finale ale primului gradient. Totuși, diferența la nivelul % B pentru condițiile inițiale și finale ale primului gradient trebuie să se mențină la valoare de 5 % B.

Nota 2. Eluenții trebuie degazați suficient și trebuie, de asemenea, să rămână degazați. Acest aspect este esențial pentru buna funcționare a sistemului de pompare pe bază de gradient. Deviația standard a timpului de retenție al vârfului CMPA trebuie să fie sub 0,1 minute (n = 10).

Nota 3. La fiecare cinci probe se injectează proba de referință [5] și se utilizează pentru calcularea unui nou factor de răspuns R. (9.1.1).

Rezultatele analizei cromatografice a probei de testat (E) se obțin sub forma unei cromatograme în care vârful CMPA este identificat prin timpul său de retenție de aproximativ 26 de minute

Integratorul (6.11.6) calculează automat înălțimea vârfului H a vârfului CMPA. Se verifică poziția liniei de bază în fiecare cromatogramă. În cazul în care poziția liniei de bază este incorect localizată, analiza sau integrarea se repetă.

Notă: În cazul în care vârful CMPA este suficient de separat de alte vârfuri, se utilizează alocarea liniei de bază depresiune-la-depresiune, altminteri se utilizează perpendiculare verticale până la o linie de bază comună, care trebuie să aibă punctul de plecare aproape de vârful CMPA (deci, nu la t = 0 min!). Pentru standard și pentru probe se utilizează același tip de integrare, iar în cazul utilizării liniei de bază comune se verifică coerența acesteia pentru probe și standard.

Este esențial să se examineze aspectul fiecărei cromatograme înainte de interpretarea cantitativă pentru a se detecta orice anomalii cauzate fie de funcționarea necorespunzătoare a aparaturii sau a coloanei, fie de originea sau natura probei analizate. În cazul în care există dubii, analiza se repetă.

Calibrarea

Se aplică cu exactitate procedura descrisă de la punctul 8.2 la punctul 8.4.4 utilizând probele-standard (5.4.1-5.4.2). Se utilizează soluții proaspăt preparate, deoarece CMP se degradează într-un mediu de acid tricloracetic 8 % la temperatura camerei. La 4 °C, soluția rămâne stabilă timp de 24 ore. În cazul seriilor lungi de analize este preferabil ca în injectorul automat să se utilizeze o tavă cu probe răcită.

Notă: 8.4.2. se poate omite în cazul în care % B în condițiile inițiale este cunoscut din analizele efectuate anterior.

Cromatograma probei de referință [5] trebuie să fie analoagă cu cea din Figura 1. În această figură, vârful CMPA este precedat de două vârfuri mici. Este esențial să se obțină o separare similară.

Înainte de determinarea cromatografică a probelor se injectează 100 μl din proba-standard care nu conține zer închegat [0] (5.4.1).

Pe cromatogramă nu trebuie să apară un vârf la timpul de retenție al vârfului CMPA.

Factorul de răspuns R se determină prin injectarea aceluiași volum de filtrat (8.5.1) ca și cel utilizat pentru probe.

EXPRIMAREA REZULTATELOR

Metodă de calcul și formule

Calcularea factorului de răspuns R:

Vârful CMPA: R = W/H

Unde:

Calcularea procentului de zer închegat praf din probă

W(E) = R × H(E)

Unde:

În cazul în care W(E) este mai mare de 1 % și diferența dintre timpul de retenție și cel al probei-standard (5) este mai mică de 0,2 minute, atunci sunt prezente materii solide compuse din zer închegat.

Precizia procedurii

Repetabilitatea

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate simultan sau în succesiune rapidă de către același analist utilizând aceeași aparatură pe material de testare identic nu trebuie să depășească 0,2 % m/m.

Reproductibilitatea

Nu s-a determinat.

Liniaritate

De la 0 la 16 % zer închegat trebuie să se obțină o relație liniară cu un coeficient de corelare > 0,99.

Interpretare

Limita de 1 % include incertitudinea cauzată de reproductibilitate.

Figura 1

Ni—4.6 standard

Absorbanță (220 nm)

timp (minute)

CMP A

Sistem binar de pompare pe bază de gradient

Injector, manual sau automat, cu o capacitate de 100 μl

Coloană Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (lungime 25 cm, diametru intern 0,46 cm) sau o coloană echivalentă cu fază inversată pe bază de silice cu pori largi

Cuptor cu coloană termostatic, reglat la 35 ± 1 °C

Detector UV cu lungime de undă variabilă care permite măsurători la 210 nm (în cazul în care este necesar, se poate utiliza o lungime de undă mai mare, de până la 220 nm) cu o sensibilitate de 0,02 Å

Integrator capabil să stabilească integrarea la linia de bază comună sau depresiune-la-depresiune

Tabelul 1Condițiile gradientului de explorare pentru optimizarea cromatografiei

ANEXA VI

Metode de analiză ale untului în condiții de depozitare privată

Tabelul 1

ANEXA VII

Metode de analiză a laptelui praf degresat în condiții de depozitare privată

Tabelul 1

ANEXA VIII

Metode de analiză a brânzeturilor în condiții de depozitare privată

Metoda de analiză prevăzută în apendice se utilizează pentru a se asigura faptul că brânza produsă exclusiv din lapte de oaie, de capră sau de bivoliță sau dintr-un amestec de lapte de oaie, de capră și de bivoliță nu conține cazeină din lapte de vacă.

Se consideră că este prezentă cazeina din lapte de vacă în cazurile în care conținutul de cazeină din lapte de vacă al probei analizate este egal cu sau mai mare decât conținutul probei de referință care conține 1 % lapte de vacă astfel cum se menționează în apendice.

Metodele pentru detectarea cazeinei din lapte de vacă în brânzeturile menționate la punctul 1 pot fi utilizate dacă:

limita de detecție este de maxim 0,5 %; și

nu existe rezultate fals pozitive; și

cazeina din lapte de vacă este detectabilă cu sensibilitatea necesară chiar și după perioade lungi de maturare, cum se poate întâmpla în condiții de comercializare uzuale.

Dacă niciuna dintre cerințele de mai sus nu este îndeplinită, se utilizează metodele prezentate în apendice.

limita de detecție este de maxim 0,5 %; și

nu existe rezultate fals pozitive; și

cazeina din lapte de vacă este detectabilă cu sensibilitatea necesară chiar și după perioade lungi de maturare, cum se poate întâmpla în condiții de comercializare uzuale.

Apendice

METODĂ PENTRU DETECTAREA LAPTELUI DE VACĂ ȘI A CAZEINATULUI ÎN BRÂNZETURILE PRODUSE DIN LAPTE DE OAIE, DE CAPRĂ SAU DE BIVOLIȚĂ SAU DIN AMESTECURI DE LAPTE DE OAIE, DE CAPRĂ ȘI DE BIVOLIȚĂ

DOMENIU DE APLICARE

Detectarea laptelui de vacă și a cazeinatului în brânzeturile produse din lapte de oaie, de capră, de bivoliță sau din amestecuri de lapte de oaie, de capră și de bivoliță prin focalizarea izoelectrică a γ-cazeinelor după plasminoliză.

APLICAREA ÎN PRACTICĂ

Această metodă poate fi utilizată pentru detectarea sensibilă și specifică a laptelui de vacă natural și tratat termic și a cazeinatului în brânzeturile proaspete și maturate produse din lapte de oaie, de capră, de bivoliță sau din amestecuri de lapte de oaie, de capră și de bivoliță. Nu poate fi utilizată pentru detectarea modificării laptelui și a brânzei cu concentrate proteice din zer de bovine tratate termic.

PRINCIPIUL METODEI

Izolarea cazeinelor din brânză și din standardele de referință

Dizolvarea cazeinelor izolate și supunerea lor la clivare cu plasmină (EC.3.4.21.7).

Focalizarea izoelectrică a cazeinelor tratate cu plasmină în prezența ureii și colorarea proteinelor

Evaluarea profilelor colorate de cazeină γ3 și γ2 (dovadă a prezenței laptelui de vacă) prin compararea profilului obținut din probă cu cele obținute în același gel din standardele de referință conținând 0 % și 1 % lapte de vacă.

REACTIVI

În afara cazurilor în care se indică altfel, se utilizează produse chimice de calitate analitică. Apa trebuie să fie dublu distilată sau de o puritate echivalentă.

Notă: Următoarele detalii se aplică gelurilor de poliacrilamide cu conținut de uree preparate în laborator, având dimensiunile de 265 × 125 × 0,25 mm. În cazul în care se utilizează geluri de alte dimensiuni sau tipuri, poate fi necesară ajustarea condițiilor de separare.

Focalizarea izoelectrică

Reactivi pentru producerea gelurilor de poliacrilamide cu conținut de uree

Soluție-stoc de gel

Se dizolvă:

4,85 g acrilamidă

0,15 g N, N'-metilen-bis-acrilamidă (BIS)

48,05 g uree

15,00 g glicerol (87 % m/m),

în apă și se completează până la 100 ml, apoi se toarnă într-un recipient de sticlă de culoare maro și se depozitează în frigider.

Notă: În locul cantităților fixe de acrilamide neurotoxice menționate se poate utiliza o soluție de acrilamidă/BIS preamestecată disponibilă în comerț. În cazul în care o astfel de soluție conține 30 % m/V acrilamidă și 0,8 % m/V BIS, pentru preparare se utilizează un volum de 16,2 ml de soluție în locul cantităților fixate. Termenul de valabilitate a soluției-stoc este de maxim 10 zile; în cazul în care conductivitatea sa este mai mare de 5 μS, se deionizează prin agitare cu 2 g Amberlite MB-3 timp de 30 minute, apoi se filtrează printr-o membrană cu pori de 0,45 μm.

Soluția de gel

Se prepară o soluție de gel amestecând aditivi și amfoliți (*) cu soluția-stoc de gel (a se vedea 4.1.1).

9,0 ml soluție-stoc

24 mg β-alanină

500 μl amfolit pH 3,5-9,5

250 μl amfolit pH 5-7

250 μl amfolit pH 6-8

Se amestecă soluția sub formă de gel și se degazează timp de două-trei minute într-o baie cu ultrasunete sau în vid.

Notă: Soluția sub formă de gel se prepară imediat înainte de a o turna (6.2).

Soluții-catalizator

N, N, N′ N′ – tetrametiletilendiamină (Temed)

40 % m/V persulfat de amoniu (PER):

Se dizolvă 800 mg de PER în apă și se completează până la 2 ml.

Notă: Întotdeauna se utilizează soluție PER proaspăt preparată.

Fluid de contact

Kerosen sau parafină lichidă

Soluție anodică

Se dizolvă în apă 5,77 g acid fosforic (85 % m/m) și se diluează până la 100 ml.

Soluție catodică

Se dizolvă în apă 2,00 g hidroxid de sodiu și se diluează până la 100 ml.

Pregătirea probei

Reactivi pentru izolarea proteinelor

Se diluează acid acetic (25,0 ml acid acetic glacial completat cu apă până la 100 ml)

Diclormetan

Acetonă

Soluție-tampon pentru dizolvarea proteinelor

Se dizolvă

5,75 g glicerol (87 % m/m)

24,03 g uree

250 mg ditiotreitol

în apă și se completează până la 50 ml

Notă: Se păstrează în frigider, termenul de valabilitate maxim fiind de o săptămână.

Reactivi pentru clivarea cu plasmină a cazeinelor

Soluție-tampon de carbonat de amoniu

Se titrează până la pH 8 o soluție de carbonat acid de amoniu 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml apă) conținând acid etilendiaminotetraacetic 0,05 mol/l (EDTA, 1,46 g/100 ml) cu o soluție de carbonat de amoniu 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml apă) conținând 0,05 mol/l EDTA.

Plasmină de bovine (EC. 3.4.21.7), activitate de minim 5 U/ml

Soluție de acid ε-aminocaproic pentru inhibarea enzimelor

Se dizolvă 2,624 g acid ε-aminocaproic (acid 6-amino-n-hexanoic) în 100 ml de etanol 40 % (V/V).

Standarde

De la Institutul pentru Materiale și Măsurători de Referință al Comisiei, B-2440 Geel, Belgia, pot fi obținute standarde de referință certificate compuse din amestecuri de lapte închegat de oaie și de capră conținând 0 %, respectiv 1 %, lapte de vacă.

Prepararea standardelor de referință provizorii de laborator din lapte de bivoliță închegat conținând 0 % și 1 % lapte de vacă

Laptele degresat se prepară prin centrifugarea laptelui crud în vrac de bivoliță sau de vacă la 37 °C, la 2500 g, timp de 20 minute. După răcirea rapidă a tubului și a conținutului la 6-8 °C, stratul superior de lipide se îndepărtează complet. Pentru prepararea standardului 1 % se adaugă 5,00 ml de lapte de bovine degresat la 495 ml lapte de bivoliță degresat într-un vas de 1 l, se ajustează pH-ul la 6,4 prin adăugarea de acid lactic diluat (10 % m/V). Se ajustează temperatura la 35 °C și se adaugă 100 μl de cheag de vițel (activitatea cheagului 1: 10000, c. 3000 U/ml), se amestecă timp de 1 minut, apoi se lasă vasul, acoperit cu o folie de aluminiu, la 35 °C timp de o oră pentru a permite formarea coagulului. După formarea acestuia, întregul laptele închegat este liofilizat fără omogenizare prealabilă și fără a se drena zerul. După liofilizare, produsul se macină mărunt până se obține o pulbere omogenă. Pentru prepararea standardului 0 %, se urmează aceeași procedură utilizând lapte degresat de bivoliță autentic. Standardele se păstrează la – 20 °C.

Notă: Înaintea preparării standardelor se recomandă verificarea purității laptelui de bivoliță prin focalizarea izoelectrică a cazeinelor tratate cu plasmină.

Reactivi pentru colorarea proteinelor

Fixativ

Se dizolvă în apă 150 g de acid tricloracetic și se completează până la 1000 ml.

Soluție pentru decolorare

Se diluează 500 ml de metanol și 200 ml de acid acetic glacial cu apă distilată până la 2000 ml.

Notă: Se prepară zilnic o soluție proaspătă de decolorare; ea poate fi preparată prin amestecarea unor volume egale de soluții-stoc de metanol 50 % (V/V) și de acid acetic glacial 20 % (V/V).

Soluții pentru colorare

Soluție pentru colorare (soluție-stoc 1)

Se dizolvă 3,0 g Albastru Coomassie Brilliant G-250 (C.I. 42655) în 1000 ml metanol 90 % (V/V) utilizând un agitator magnetic (timp de aproximativ 45 minute), apoi se filtrează prin două filtre pliate de viteză medie.

Soluție pentru colorare (soluție-stoc 2)

Se dizolvă 5,0 g sulfat de cupru pentahidrat în 1000 ml de acid acetic 20 % (V/V).

Soluție pentru colorare (soluție de lucru)

Se amestecă câte 125 ml din fiecare soluție-stoc (4.11.1, 4.11.2) imediat înainte de colorare.

Notă: Soluția pentru colorare se prepară în ziua în care este utilizată.

ECHIPAMENTE

Plăci de sticlă (265 × 125 × 4 mm); rolă de cauciuc (lățime 15 cm); masă reglabilă

Foaie purtătoare de gel (265 × 125 mm)

Foaie de acoperire (280 × 125 mm) Se lipește bandă adezivă (280 × 6 × 0,25 mm) pe fiecare latură lungă (a se vedea figura 1)

Cuvă de electrofocalizare cu placă de răcire (de exemplu 265 × 125 mm) cu unitate de alimentare electrică adecvată (≥ 2,5 kV) sau cu dispozitiv automat de electroforeză

Criostat de circulație, controlat termostatic la 12 ± 0,5 °C

Centrifugă ajustabilă la 3000 g

Benzi de electrozi (lungime ≥ 265 mm)

Sticle picurătoare din plastic pentru soluțiile anodice și catodice

Aplicatoare de probe (10 × 5 mm, hârtie de filtrare din viscoză sau cu absorbție mică a proteinelor).

Vase din oțel inoxidabil sau din sticlă pentru colorare și decolorare (de exemplu, tăvi de instrumente de 280 × 150 mm)

Omogenizator ajustabil cu tijă (diametrul tijei 10 mm), intervalul rpm 8000-20000

Agitator magnetic

Baie cu ultrasunete

Aparat de sudat folii

Micropipete de 25 μl

Concentrator sub vid sau liofilizator

Baie de apă controlată termostatic, ajustabilă la 35 și 40 ± 1 °C, cu agitator

Echipament de densitometrie cu citire la λ = 634 nm

PROCEDURA

Pregătirea probei

Izolarea cazeinelor

Se cântărește într-un tub de centrifugă de 100 ml echivalentul a 5 g materie uscată de brânză sau standarde de referință, se adaugă 60 ml apă distilată și se omogenizează cu un omogenizator cu tijă (8000-10000 rpm). Se ajustează la pH de 4,6 cu o soluție de acid acetic diluat (4.5.1) și se centrifughează (5 minute, 3000 g). Se decantează lipidele și zerul, se omogenizează reziduul la 20000 rpm în 40 ml apă distilată ajustată la pH de 4,5 cu acid acetic diluat (4.5.1), se adaugă 20 ml diclormetan (4.5.2), se omogenizează din nou și se centrifughează (5 minute, 3000 g). Se îndepărtează cu o spatulă stratul de cazeină care se află între faza apoasă și cea organică (a se vedea figura 2) și se elimină ambele faze. Se reomogenizează cazeina în 40 ml apă distilată (a se vedea mai sus) și în 20 ml diclormetan (4.5.2), apoi se centrifughează. Se repetă procedura până când ambele faze de extracție sunt incolore (de două sau de trei ori). Se omogenizează reziduul proteic cu 50 ml acetonă (4.5.3) și se filtrează printr-o hârtie de filtrare pliată de viteză medie. Se spală de fiecare dată reziduul de pe filtru cu câte două porții separate de 25 ml acetonă și se lasă să se usuce în aer sau sub jet de azot, apoi se macină fin într-un mojar.

Notă: Izolatele de cazeină uscată se păstrează la – 20 °C.

Clivarea cu plasmină a ß-cazeinelor pentru intensificarea γ-cazeinelor

Se dispersează 25 mg cazeine izolate (6.1.1) în 0,5 ml soluție-tampon de carbonat de amoniu (4.7.1) și se omogenizează timp de 20 minute utilizând, de exemplu, tratament ultrasonic. Se încălzește la 40 °C și se adaugă 10 μl plasmină (4.7.2), apoi se amestecă și se incubează timp de o oră la 40 °C, agitând continuu. Pentru a inhiba enzima se adaugă 20 μl soluție de acid ε-aminocaproic (4.7.3), apoi se adaugă 200 mg de uree solidă și 2 mg de ditiotreitol.

Notă: Pentru a obține o simetrie mai mare a benzilor de cazeină focalizate se recomandă liofilizarea soluției după adăugarea acidului ε-aminocaproic și apoi dizolvarea reziduurilor în 0,5 ml soluție-tampon pentru dizolvarea proteinelor (4.6).

Prepararea gelurilor poliacrilamidice care conțin uree

Cu ajutorul câtorva picături de apă se rulează foaia purtătoare de gel (5.2) pe o placă de sticlă (5.1), îndepărtându-se surplusul de apă cu un șervețel din hârtie sau textil. Se rulează în mod similar foaia de acoperire (5.3) cu distanțiere (0,25 mm) pe o altă placă de sticlă. Se așează placa orizontal pe o masă reglabilă.

Se adaugă 10 μl Temed (4.1.3.1) la soluția de gel pregătită și dezaerată (4.1.2), se amestecă și se adaugă 10 μl soluție PER (4.1.3.2), se amestecă minuțios și se toarnă imediat uniform în centrul foii de acoperire. Se pune o margine a plăcii purtătoare de gel (cu latura foii îndreptată în jos) pe placa de acoperire a foii și se coboară încet astfel încât între foi să se formeze un strat subțire de gel, care se întinde uniform și fără bule (figura 3). Se coboară cu grijă placa purtătoare de gel, complet, utilizând o spatulă fină, apoi se așează încă trei plăci de sticlă deasupra ei pentru a acționa ca greutăți. După încheierea polimerizării (aproximativ 60 minute), se transferă gelul polimerizat pe foaia purtătoare de gel împreună cu foaia de acoperire, înclinând plăcile de sticlă. Se curăță cu grijă reversul foii purtătoare pentru a îndepărta reziduurile de gel și ureea. Sandvișul de gel se sudează astfel încât să se obțină un tub cu perete pelicular și se păstrează în frigider (timp de maxim șase săptămâni).

Notă: Foaia de acoperire și distanțierele pot fi reutilizate. Gelul de poliacrilamidă poate fi tăiat la dimensiuni mai mici, acțiune recomandată în cazul în care există puține probe sau în care se utilizează un aparat automat de electroforeză (două geluri, dimensiuni 4,5 × 5 cm).

Focalizare izoelectrică

Se reglează termostatul de răcire la 12 °C. Se șterge cu kerosen reversul foii purtătoare de gel, apoi se picură câteva picături de kerosen (4.2) în centrul blocului de răcire. Apoi se rulează sandvișul de gel, cu partea purtătoare îndreptată în jos, pe el, având grijă să se evite formarea bulelor. Se șterge excesul de kerosen și se îndepărtează foaia de acoperire. Se îmbibă benzile de electrozi în soluțiile electrodice (4.3, 4.4), se taie după lungimea gelului și se plasează în pozițiile prevăzute (distanța dintre electrozi de 9,5 cm).

Condiții pentru focalizarea izoelectrică:

Dimensiunile gelului 265 × 125 × 0,25 mm

Notă: În cazul în care se modifică grosimea sau lățimea gelurilor, atunci intensitatea și puterea trebuie ajustate în consecință (de exemplu, în cazul în care se utilizează un gel de 265 × 125 × 0,5 mm valorile pentru intensitatea și puterea curentului electric se dublează).

Exemplu de program de tensiune pentru un dispozitiv automat de electroforeză (2 geluri de 5,0 × 4,5 cm), cu electrozi fără benzi, aplicați direct pe gel

Se plasează aplicatorul probei în etapa 2 la 0 Vh.

Se îndepărtează aplicatorul probei în etapa 2 la 30 Vh.

Colorarea proteinelor

Fixarea proteinelor

Se îndepărtează benzile de electrozi imediat după oprirea curentului electric și se plasează imediat gelul într-un vas de colorare/decolorare umplut cu 200 ml de fixativ (4.9); se lasă timp de 15 minute, agitând în continuu.

Spălarea și colorarea plăcii de gel

Se drenează cu grijă fixativul și se spală placa de gel de două ori, timp de câte 30 de secunde, cu 100 ml soluție decolorantă (4.10). Se scurge soluția decolorantă și se umple vasul cu 250 ml de soluție colorantă (4.11.3); se lasă să se coloreze timp de 45 minute agitându-se ușor.

Decolorarea plăcii de gel

Se scurge soluția colorantă, se spală placa de gel de două ori cu câte 100 ml de soluție decolorantă (4.10), apoi se agită timp de 15 minute cu 200 ml de soluție decolorantă și se repetă etapa de decolorare de cel puțin două sau trei ori, până când fundalul este limpede și necolorat. Se clătește apoi placa de gel cu apă distilată (2 × 2 minute) și se usucă la aer (2-3 ore) sau cu un uscător de păr (10-15 minute).

Nota 1: Fixarea, spălarea, colorarea și decolorarea se efectuează la 20 °C. Nu utilizați temperaturi ridicate.

Nota 2: În cazul în care se preferă colorarea mai sensibilă cu argint (de exemplu, Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, cod nr. 17-1150-01), probele de cazeină tratate cu plasmină trebuie diluate la 5 mg/ml.

EVALUARE

Evaluarea este efectuată prin compararea profilelor proteice ale probei necunoscute cu standardele de referință pe același gel. Detectarea laptelui de vacă în brânzeturile din lapte de oaie, de capră și de bivoliță și în amestecurile de lapte de oaie, de capră și de bivoliță se face prin intermediul cazeinelor γ3 și γ2, ale căror puncte izoelectrice se află în intervalul de pH 6,5-7,5 (figurile 4 a, b, figura 5). Limita de detecție este mai mică de 0,5 %.

Estimare vizuală

Pentru evaluarea vizuală a cantității de lapte de bovine se recomandă ajustarea concentrațiilor probelor și a standardelor pentru a obține același nivel de intensitate a cazeinelor γ2 și γ3 din lapte de ovine, de caprine și/sau de bivolițe (a se vedea γ2 E,G,B și γ3 E,G,B în figurile 4 a, b și în figura 5). După aceasta, nivelul de lapte de bovine (mai mic decât, egal cu sau mai mare de 1 %) din proba necunoscută poate fi apreciat direct, prin compararea intensității cazeinelor γ3 și γ2 din laptele de bovine (a se vedea γ3 C și γ2 C din figurile 4 a, b și din figura 5) cu cele ale standardelor de referință de 0 % și 1 % (oaie, capră) sau cu standardele provizorii de laborator (bivoliță).

Estimare densitometrică

În cazul în care este disponibilă, se aplică densitometria (5.19) pentru determinarea raportului dintre aria vârfurilor pentru cazeinele γ2 și γ3 din laptele de bovine, caprine și/sau bivoliță (a se vedea figura 5). Această valoare se compară cu raportul dintre aria vârfurilor cazeinelor γ2 și γ3 ale standardului de referință 1 % (oaie, capră) sau ale standardului provizoriu de laborator (bivoliță), analizate pe același gel.

Notă: Metoda funcționează satisfăcător în cazul în care se obține un semnal pozitiv clar pentru ambele cazeine γ2 și γ3 din laptele de bovine în standardul de referință 1 %, dar nu și în standardul de referință 0 %. În caz contrar, procedura se optimizează respectându-se cu exactitate detaliile metodei.

O probă este considerată pozitivă în cazul în care ambele cazeine γ2 și γ3 din laptele de bovine sau rapoartele ariei vârfurilor corespunzătoare sunt egale cu sau mai mari decât nivelul standardului de referință 1 %.

REFERINȚE

Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient – isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp. 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

Figura 1

Desen schematic al foii de acoperire

Foaie de poliester

Bandă de distanțiere

Figura 2

Strat de cazeină suspendat între fazele apoasă și organică după centrifugare

Faza H2O

Cazeină

Faza CH2Cl2

Figura 3

Tehnică de pliere pentru formarea straturilor ultrafine de geluri poliacrilamidice

a = bandă de distanțiere (0,25 mm); b = foaie de acoperire (5.3); c, e = plăci de sticlă (5.1); d = soluție de gel (4.1.2); f = foaie purtătoare de gel (5.2)

Figura 4a

Focalizare izoelectrică a cazeinelor tratate cu plasmină din brânză din lapte de oaie și de capră conținând diverse cantități de lapte de vacă

% CM = procent de lapte de vacă; C = vacă; E = oaie; G = capră

Jumătatea de sus a gelului IEF este ilustrată.

Figura 4b

Focalizare izoelectrică a cazeinelor tratate cu plasmină provenite din brânză produsă din amestecuri de lapte de oaie, de capră și de bivoliță conținând diverse cantități de lapte de vacă

% CM = procent de lapte de vacă; 1 + = probă conținând 1 % lapte de vacă și modificat cu cazeină pură din lapte de bovine la mijlocul traiectului. C = vacă, E = oaie, G = capră, B = bivoliță.

Distanța de separare totală a felului IEF este ilustrată.

Figura 5

Suprapunerea densitogramelor standardelor (STD) și a probelor de brânză produse dintr-un amestec de lapte de oaie și de capră după focalizare izoelectrică

a,b = standarde conținând 0 și 1 % lapte de vacă; c-g = probe de brânză conținând 0, 1, 2, 3 și 7 % lapte de vacă. C = vacă, E = oaie, G = capră.

Jumătatea de sus a gelului IEF a fost scanată la λ = 634 nm.

4,85 g acrilamidă

0,15 g N, N'-metilen-bis-acrilamidă (BIS)

48,05 g uree

15,00 g glicerol (87 % m/m),

9,0 ml soluție-stoc

24 mg β-alanină

500 μl amfolit pH 3,5-9,5

250 μl amfolit pH 5-7

250 μl amfolit pH 6-8

5,75 g glicerol (87 % m/m)

24,03 g uree

250 mg ditiotreitol

Tabelul 1

Tabelul 2

ANEXA IX

Evaluarea analizelor

Asigurarea calității

Analizele se efectuează de laboratoare desemnate în conformitate cu articolul 12 din Regulamentul (CE) nr. 882/2004 (**) sau desemnate de autoritățile competente ale statului membru.

Prelevarea probelor și litigiile referitoare la rezultatele analizelor

Prelevarea de probe se efectuează în conformitate cu regulamentul relevant pentru produsul în cauză. În cazul în care nu există dispoziții exprese privind prelevarea de probe, se utilizează dispozițiile prevăzute în ISO 707, Lapte si produse lactate – Orientări privind prelevarea de probe.

Rapoartele de laborator cu rezultatele analizelor trebuie să conțină suficiente informații pentru a se putea efectua o evaluare a rezultatelor în conformitate cu apendicele.

Pentru analizele necesare în baza reglementărilor Uniunii se prelevează probe duplicat.

În cazul în care apare un litigiu referitor la rezultate, agenția de plăți efectuează din nou analizele necesare pe produsul în cauză, costurile fiind suportate de partea care pierde.

Analizele de mai sus se efectuează dacă există probe duplicat sigilate prelevate din produs și dacă acestea au fost depozitate corespunzător de autoritatea competentă. Producătorul trimite o cerere la agenția de plăți pentru a efectua analiza în termen de 7 de zile lucrătoare de la notificarea rezultatelor primei analize. Analiza se efectuează de către agenția de plăți în termen de 21 de zile lucrătoare de la primirea cererii.

Rezultatul obținut în urma contestației este cel definitiv.

În cazul în care producătorul poate dovedi, în termen de cinci zile lucrătoare de la prelevarea probelor, că procedura de prelevare a probelor nu a fost efectuată corect, aceasta trebuie repetată, dacă este posibil. Dacă prelevarea de probe nu este posibilă, transportul se acceptă.

Apendice

Evaluarea conformității unui transport în raport cu limitele stabilite în legislație

Principiu

În cazul în care legislația privind intervenția publică și depozitarea privată prevede proceduri detaliate de prelevare a probelor, aceste proceduri trebuie să fie respectate. În toate celelalte cazuri se utilizează o probă compusă din cel puțin 3 unități de probă luate aleator din transportul supus controlului. Se poate prepara o probă compusă. Rezultatul obținut este comparat cu limitele stabilite în legislație prin calcularea unui interval de încredere de 95 % ca 2 × deviația standard, unde deviația standard relevantă depinde (1) de validarea metodei prin colaborare internațională cu valori pentru σr și σR sau (2) în cazul validării interne, de calcularea reproductibilității interne. Acest interval de încredere va fi apoi comparat cu incertitudinea de măsurare a rezultatului.

Metoda este validată prin colaborare internațională

În acest caz, deviația standard σr a repetabilității și deviația standard σR a reproductibilității au fost stabilite, iar laboratorul poate demonstra conformitatea cu caracteristicile de performanță a metodei validate.

Se calculează media aritmetică x a seriei de n măsurători repetate.

Se calculează incertitudinea extinsă (k = 2) a x ca

În cazul în care rezultatul final x al măsurătorii este calculat utilizând o formulă de forma x = y1 + y2, x = y1 – y2, x = y1 · y2 sau x = y1/y2, se respectă procedurile uzuale de combinare a deviațiilor standard în astfel de cazuri.

Transportul este considerat ca nefiind în conformitate cu limita superioară UL stabilită în legislație dacă

xU > UL ;

altminteri este considerat ca fiind în conformitate cu UL.

Transportul este considerat ca nefiind în conformitate cu limita inferioară LL stabilită în legislație dacă

xU < LL ;

altminteri este considerat ca fiind în conformitate cu LL.

Validare internă cu calcularea deviației standard a reproductibilității interne

În cazurile în care se utilizează metode care nu sunt specificate în prezentul regulament și nu au fost stabilite măsuri de precizie, se efectuează o validare internă. Deviația standard a repetabilității interne sir și deviația standard a reproductibilității interne siR se utilizează în loc de σr, respectiv σR, în formulele de calculare a incertitudinii extinse U.

Regulile care trebuie urmate pentru a determina conformitatea cu limita stabilită în legislație sunt cele prezentate la punctul 1. Totuși, în cazul în care transportul este considerat neconform cu limita stabilită în legislație, măsurătorile se repetă cu metoda specificată în prezentul regulament, iar rezultatul se evaluează în conformitate cu punctul 1.